奧林巴斯顯微鏡激光共聚焦的應(yīng)用

激光共聚焦顯微鏡的廣泛應(yīng)用，包括在神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的各種各樣的研究，以及廣泛的細(xì)胞和組織形態(tài)學(xué)研究。 此外，越來(lái)越多地使用新的熒光蛋白的數(shù)量正在迅速擴(kuò)大的耦合這些有用的工具，以現(xiàn)代微觀調(diào)查研究報(bào)告原文。 其他應(yīng)用包括共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，干細(xì)胞研究，漂白研究，壽命成像，多光子顯微鏡，全內(nèi)反射，DNA雜交，膜和離子探針，生物發(fā)光蛋白，抗原表位標(biāo)記。 下列各節(jié)中描述的許多這些**的技術(shù)。

在共聚焦顯微鏡的熒光基團(tuán)的共定位 -乘法熒光標(biāo)記標(biāo)本的檢查和數(shù)字記錄期間，兩個(gè)或兩個(gè)以上的發(fā)射信號(hào)往往可以重疊在*終圖像中，由于其靠近內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)。 這種效應(yīng)被稱為共存 ，通常發(fā)生在熒光標(biāo)記分子結(jié)合到目標(biāo)在于非常接近或相同的空間位置。 具有高度特異性的現(xiàn)代化合成熒光和古典免疫技術(shù)的應(yīng)用已顯著提高，加上精密光學(xué)部分和數(shù)字圖像處理共聚焦和多光子顯微鏡所提供的馬力，能夠檢測(cè)生物樣品中的共存。

熒光探針 -在一般情況下，熒光探針的分類和應(yīng)用分類根據(jù)它們的激發(fā)和發(fā)射特性，以及它們的化學(xué)和生物特性。 本節(jié)中的例子在每一個(gè)重要的生物類，包括核酸，多糖，脂質(zhì)，細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，離子濃度，特定的細(xì)胞器中的探針的制表。 免疫試劑熒光蛋白探針在熒光顯微鏡具有根本的重要性。

熒光燈和發(fā)光蛋白 -在過(guò)去的幾年中，在調(diào)查的基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)與綠色熒光蛋白（GFP）和它的許多遺傳變異的研究已成為一個(gè)主要的主食。 另外，熒光素酶和水母發(fā)光蛋白的生物發(fā)光蛋白為研究細(xì)胞內(nèi)的離子濃度的波動(dòng)，和腺苷三磷酸（ATP）的檢測(cè)，是有用的。 現(xiàn)在市售的這些發(fā)光和熒光蛋白的光譜變種，打開(kāi)多個(gè)標(biāo)簽在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的可能性。

綠色熒光蛋白（GFP） -綠色熒光蛋白（GFP）及其光譜變體（黃色，YFP），青色（CFP），藍(lán)色（BFP），紅色（dsRFP））是在迅速成為重要的研究工具各學(xué)科與生命科學(xué)領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)和生物學(xué)。 互聯(lián)網(wǎng)的快速搜索*近的文獻(xiàn)揭示每個(gè)月幾十個(gè)或多個(gè)報(bào)告。 綠色熒光蛋白*初是從水母中分離是一個(gè)專門的蛋白質(zhì)，當(dāng)暴露于激發(fā)光，發(fā)出熒光。 其主要用于當(dāng)前研究的重要性在于在純化水母GFP基因在其它生物體中表達(dá)熒光蛋白的能力。 當(dāng)一種非特異性的熒光蛋白質(zhì)（或其變體的嵌合體）的基因?qū)氲慕M織培養(yǎng)線，整個(gè)細(xì)胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光。

過(guò)去幾年中，具有幾乎跨越了整個(gè)可見(jiàn)光光譜的熒光光譜熒光蛋白調(diào)色板 -已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列廣泛的熒光蛋白遺傳變異。 誘變廣泛的努力，在原來(lái)的水母蛋白導(dǎo)致新的熒光探針，該范圍內(nèi)的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，有一些體內(nèi)報(bào)告分子在生物學(xué)研究中*廣泛使用的。 更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光蛋白，散發(fā)橙色和紅色光譜區(qū)域，已制定了從海洋海葵Discosoma芨屬于類珊瑚蟲(chóng)和珊瑚。 還有其他物種已被開(kāi)采產(chǎn)生類似的蛋白質(zhì)，有青色，綠色，黃色，橙色，紅色，和遠(yuǎn)紅光的熒光發(fā)射。 發(fā)展的研究工作是不斷提升的亮度和穩(wěn)定的熒光蛋白，從而提高他們的整體實(shí)用性。

光學(xué)熒光筆熒光蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)分子可以激活從靜止?fàn)顟B(tài)啟動(dòng)熒光（這個(gè)過(guò)程被稱為光活化 ），或能夠被光轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射帶寬從一個(gè)到另一個(gè)（ 光電轉(zhuǎn)換 ），代表可能是*有前途的在體內(nèi)蛋白質(zhì)的壽命，運(yùn)輸和周轉(zhuǎn)率的調(diào)查方法。 適當(dāng)稱為分子或光熒光筆 ，一般很少或根本沒(méi)有顯示的光活化熒光蛋白成像波長(zhǎng)的激發(fā)下初始熒光，但顯著提高其熒光強(qiáng)度照射激活后，在不同的波長(zhǎng)（通常較低）。 光轉(zhuǎn)化光學(xué)熒光筆，另一方面，經(jīng)過(guò)時(shí)光學(xué)變化的生色團(tuán)的熒光發(fā)射帶寬配置的變化。 這些影響導(dǎo)致的直接和受控的高亮顯示的不同的分子在細(xì)胞內(nèi)池。

胚胎干細(xì)胞 -胚胎干細(xì)胞系，這是*初從人類囊胚的內(nèi)芯，以及其他哺乳動(dòng)物，現(xiàn)在研究界廣泛成立于使用傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)。 細(xì)胞株傳代過(guò)程中保持其未分化狀態(tài)和正常核，但是，他們?nèi)匀荒軌蚍只蓭缀跞魏晤愋偷慕M織。 *增殖的胚胎干細(xì)胞成為干細(xì)胞（如神經(jīng)元干細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，造血干細(xì)胞），根據(jù)在特定的培養(yǎng)條件下，然后分化成神經(jīng)細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞。 然而，不像受精卵，胚胎干細(xì)胞的群集不能獨(dú)立發(fā)展成一個(gè)人（或其它動(dòng)物）。

抗原表位標(biāo)記的 -抗原表位（也稱為抗原決定簇的 ）是一種生物結(jié)構(gòu)或序列，如一個(gè)蛋白質(zhì)或碳水化合物，這是作為抗原的抗體，該抗體識(shí)別的。 識(shí)別的抗原發(fā)生適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)時(shí)，形成的區(qū)域中的蛋白質(zhì)或氨基酸或糖多糖，其中的直線排列。 大多數(shù)蛋白質(zhì)通常有幾種表位。 的抗體提供了一個(gè)重要的技術(shù)（稱為免疫測(cè)定法 ），用于識(shí)別特定的細(xì)胞成分（蛋白質(zhì)，脂類，碳水化合物等）來(lái)跟蹤感興趣的活的細(xì)胞和固定細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的功能，分發(fā)和修改。

熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM） -多色用熒光染料染色觀察生物材料（如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸，和離子）的分布的組織和細(xì)胞的研究領(lǐng)域中積極使用。 熒光觀察的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)單一的熒光染料分子的水平下*好的情況下，可以檢測(cè)到。 本節(jié)回顧熒光壽命成像顯微鏡（FLIM），一個(gè)新的熒光顯微鏡技術(shù)的幾個(gè)重要方面。 此外多色染色，還可以利用熒光壽命成像可視化的因素的影響，也就是說(shuō)，在分子周圍的環(huán)境的狀態(tài)的染料分子的熒光壽命特性。

熒光光漂白調(diào)查 -這兩種熒光漂白損失（ 翻轉(zhuǎn) ）和相關(guān)方法漂白后恢復(fù)（FRAP）技術(shù)通過(guò)漂白的熒光觀察細(xì)胞內(nèi)的材料的運(yùn)動(dòng)。 甲一個(gè)浮動(dòng)的細(xì)胞膜上的熒光染料，一種細(xì)胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）膜，或一個(gè)浮動(dòng)的熒光標(biāo)記蛋白，這些膜的特定區(qū)域的漂白，和被觀察到的檢查流動(dòng)性的損失或恢復(fù)熒光的橫向方向。 FLIP和FRAP的技術(shù)也可用來(lái)確認(rèn)膜的連續(xù)性。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） -活細(xì)胞中特定的分子物種之間的相互作用的確切位置和性質(zhì)，是許多生物研究領(lǐng)域的重大利益，但調(diào)查往往阻礙了研究這些儀器的分辨率有限現(xiàn)象。 傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的分子內(nèi)定義的瑞利判據(jù)，約200納米（0.2微米）的光空間分辨率的限制使本地化。 但是，為了理解在典型的生物分子的過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)貿(mào)易伙伴之間的物理相互作用，分子的相對(duì)接近必須比衍射極限的傳統(tǒng)光學(xué)成像方法允許更精確地確定。 時(shí)，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡， 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （更通常被稱為用首字母縮略詞FRET）的技術(shù)允許測(cè)定兩個(gè)分子之間的方法，在幾納米范圍內(nèi)的距離足夠接近，分子間的相互作用發(fā)生。

多光子顯微鏡 -多光子熒光顯微鏡是一種強(qiáng)有力的研究工具，它結(jié)合了*的光學(xué)技術(shù)，長(zhǎng)波長(zhǎng)多光子激發(fā)激光掃描顯微鏡捕捉到高分辨率三維圖像高度特異性熒光標(biāo)記標(biāo)本。 該技術(shù)具有三維分辨熒光成像的共聚焦顯微鏡成像活細(xì)胞和組織有吸引力的優(yōu)勢(shì)。 多光子激發(fā)只發(fā)生在顯微鏡的焦點(diǎn)，*大限度地減少漂白和光損傷，活細(xì)胞成像的*終限制因素。 這一優(yōu)勢(shì)使厚的活組織標(biāo)本，否則不會(huì)有可能與傳統(tǒng)的成像技術(shù)的調(diào)查。

全內(nèi)反射熒光顯微鏡 -全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）是一個(gè)優(yōu)雅的光學(xué)技術(shù)，用來(lái)觀察單分子熒光表面和界面。 該技術(shù)通常采用調(diào)查分子相互作用的表面，這是根本的重要性在細(xì)胞和分子生物學(xué)學(xué)科廣泛的面積。 全內(nèi)反射螢光顯微鏡的基本概念是簡(jiǎn)單的，只需要一個(gè)激發(fā)光束通過(guò)固體的玻璃蓋玻片或塑料組織培養(yǎng)容器，其中細(xì)胞粘附旅客在一個(gè)較高的入射角。 玻璃相和水相之間的折射率差調(diào)節(jié)光線如何被折射或反射的界面處作為入射角的函數(shù)。 在一個(gè)特定的臨界角的光被完全反射的光束從玻璃/水界面，而不是通過(guò)折射，根據(jù)斯涅耳定律。 在水性介質(zhì)中，具有相同的頻率的入射光的反射產(chǎn)生一個(gè)非常薄的電磁場(chǎng)（通常小于200納米）。

纖維的FISH（ 熒光原位雜交） -長(zhǎng)期纖維的FISH指的普遍做法延長(zhǎng)染色質(zhì)纖維制劑（FISH）進(jìn)行熒光原位 。 映射還通過(guò)進(jìn)行FISH調(diào)查，在染色體上的DNA片段，在幾百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的距離之內(nèi)的信號(hào)彼此由于多方面的結(jié)構(gòu)在中期染色體的DNA鏈?zhǔn)菬o(wú)法區(qū)分的。 染色體信號(hào)的分辨率提高了，如果之前使用它們進(jìn)步充分冷凝。 我們可以做些什么，當(dāng)我們要映射多個(gè)相鄰的DNA克隆嗎？ 創(chuàng)建地圖規(guī)模的一個(gè)堿基對(duì)整個(gè)基因組DNA序列的特性，將解決這個(gè)問(wèn)題，但是是非常耗時(shí)的。

cameleons：鈣離子的探針 - Cameleons是一類新的活細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的指標(biāo)，通過(guò)構(gòu)象變化，在鈣離子存在下的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的結(jié)果。 在過(guò)去，熒光探針，例如，印度的Fura-2和Fluo-3用于測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度的波動(dòng)是非常普遍的。 在1997年，宮脅淳光，日本理化學(xué)研究所腦科學(xué)研究所博士開(kāi)發(fā)了一種新型的鈣離子探針測(cè)量。 探頭由人工修改綠色熒光蛋白（GFP）的蛋白質(zhì)，并命名為卡默萊昂 （變色龍爬行動(dòng)物后，，但去掉名稱中的“H”）。兩個(gè)熒光蛋白（具有不同的激發(fā)和發(fā)射特性），鈣調(diào)蛋白（CAM），肌球蛋白輕鏈激酶（M13）和鈣調(diào)蛋白結(jié)合域之間的融合產(chǎn)品是仿照的卡默萊昂分子結(jié)構(gòu)。 鈣調(diào)素結(jié)合的與游離的鈣離子和M13鏈后，它已綁定的鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的能力。 直線接合的這四種蛋白質(zhì)的基因，該融合基因的表達(dá)在各種細(xì)胞中。

試樣制備合成熒光基團(tuán)和間接免疫熒光 -激光共聚焦顯微鏡變得不僅僅是一個(gè)新奇在20世紀(jì)80年代初，由于廣角熒光的應(yīng)用研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能上去。 由于免疫熒光技術(shù)，以及廣泛使用合成熒光染色的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，成為20世紀(jì)70年代中后期實(shí)行，顯微鏡變得越來(lái)越沮喪，他們無(wú)法區(qū)分或記錄精細(xì)的細(xì)節(jié)廣角儀器由于干擾發(fā)生的上方和下方的熒光焦平面。 今天，激光共聚焦顯微鏡，結(jié)合新的*的合成熒光，熒光蛋白和免疫試劑的應(yīng)用時(shí)，可以探測(cè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的**的方法之一。 本節(jié)中的地址中所述的協(xié)議的試樣的制備方法合成的熒光團(tuán)耦合免疫熒光法是必要的，以固定的貼壁細(xì)胞和組織的冷凍切片，使用寬視場(chǎng)和激光共聚焦熒光顯微鏡調(diào)查。

熒光蛋白文學(xué)來(lái)源 -大大擴(kuò)展能力，可視化，在光學(xué)顯微鏡下的高時(shí)空分辨率的分子事件，熒光蛋白的代表也許是*重要的探頭曾經(jīng)開(kāi)發(fā)細(xì)胞和植物生物學(xué)調(diào)查。 隨著互聯(lián)網(wǎng)的出現(xiàn)，為國(guó)際信息傳播的一種實(shí)用的車輛，大部分的科學(xué)出版物已開(kāi)始使他們的內(nèi)容上線書(shū)的摘要形式，HTML文件和下載的便攜文檔格式（PDF）文件，可以本地進(jìn)行查看和打印。 在下面的章節(jié)包含列出的參考文獻(xiàn)索引服務(wù)的鏈接，以研究者提供了一個(gè)快速的途徑針對(duì)熒光蛋白的原創(chuàng)文學(xué)。