如何用生物顯微鏡觀察標(biāo)本？

用于生物顯微鏡觀察的標(biāo)本必經(jīng)經(jīng)過一定的準(zhǔn)備過程才能在顯微鏡下形成清晰的像i在入射照明和透射照明中，對于標(biāo)本的光學(xué)要求有很大區(qū)別，在入射照明中傷是由標(biāo)本的反射光所形成的；相反，在進(jìn)射照明中保是由透射光所形成的，在這種情況下反射光對于像的形成不僅無益，而且會降低像的清晰度。

用入射光觀察的標(biāo)本，它的準(zhǔn)備工作十分簡單，只是清潔標(biāo)本的表面并切割為適當(dāng)大小的小塊。而用透射光觀察的標(biāo)本，必須具有由于光吸收的差異而產(chǎn)生的一定反差，才能在顯微鏡下披觀察到。為此，標(biāo)本必須經(jīng)過一系列復(fù)雜的處理和制備過程，這種制備技術(shù)就是我們一般所說的生物顯微鏡技術(shù)。

從光學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，對于用透射光觀察的顯微鏡標(biāo)本有如下要求：

(1)適當(dāng)?shù)暮穸?。這種厚度在較好的光學(xué)系統(tǒng)中能夠達(dá)到盡可能高的分辨力，且與這個系統(tǒng)的場探相適應(yīng)。

(2)足夠的透明度。

(3)能夠形成建立在吸收差異上的足夠的反差。

實(shí)際上所有的生物學(xué)材料通過石措包埋、切片(或涂片)、貼附、溶蠟、透明等過程，能夠得到在厚度和透明度上符各要求的標(biāo)本，然后通過染色程序得到一定程度的反差。

通常在透射式生物顯微鏡中所使用的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)組織切片，它的厚度一般為3—7μm。在這個厚度范圍內(nèi)，當(dāng)使用低倍物鏡(例如10×)觀察時，場深對于觀察整個切片厚度是完全足夠的；當(dāng)使用高信物鏡(例如100×)觀察時，場深僅僅是這個切片厚度的很小部分(圖4．8)，不斷地從上到下移動細(xì)調(diào)可以得到切片的總體印象。因此，5—7μm厚的常規(guī)切片可以被認(rèn)為是在低放大倍數(shù)和高放大倍數(shù)理想情況之間的調(diào)和，兩者都較好地考慮到了場深和分辨力。同時由于種種原因，這種調(diào)和的厚度也滿足了實(shí)際工作中的許多要求，首先物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)不總是*直要的；其次在很薄(1—2μm)的切片中生物標(biāo)本中的立體關(guān)系就看不到了；與此相反，當(dāng)使用8—10μm或者更厚的切片時，除了分辨力上可覺察的損失而外，還會引起生物標(biāo)本中不同層次的互相重疊。

經(jīng)過固定、包埋、切片、溶蠟、透明等處理之后的動植物材料標(biāo)本是足夠薄和透明的了，但是反差很小，并且這種反差主要來自于折射和衍射。顯然，這種標(biāo)本在反差上是遠(yuǎn)不理想的。但是這可以通過降低折射效果給它覆蓋上“吸收物質(zhì)”，并通過吸收的差異而增大反差。在標(biāo)本與周圍區(qū)域之間的折射，可以通過把標(biāo)本封藏在加拿大樹被或其他人工合成的封藏介質(zhì)中的方法而減小。所有這些封藏介質(zhì)經(jīng)過揮發(fā)或聚合使其變硬之后，它們的折射率就接近被固定或被脫水的動植物組織主要成分的折射率。在大多數(shù)動植物組織中這個數(shù)值為1．5l一1．54。同時用這個方法還可以消除蓋玻片下面的反射引起的閃光。

已經(jīng)應(yīng)用了一個多世紀(jì)，并且能夠給生物顯微鏡標(biāo)本帶來較好反差的*有效方法是染色。一般沒有染色的生物標(biāo)本，特別是當(dāng)放置在具有與生物標(biāo)本相近折射率的介質(zhì)中時，像的反差是很小的。在染色的標(biāo)本中，像的反差的增大是建立在染料選擇性分布的基礎(chǔ)上。染色與未染色標(biāo)本在反差上有巨大差異。

生物切片經(jīng)常粘貼在具有26×76mm標(biāo)準(zhǔn)尺寸和1.1—1.3mm厚度的裁玻片上，裁成片的兩面應(yīng)是平行平面。對于裁濃件厚度的要求不是很嚴(yán)格的，但是當(dāng)它的厚度*過一些較高矯正程度集光器的自由工作距離時，裁玻片厚度對于聚焦光源以及在物體平面上形成祝場光闌的像就變得重要了。對于這種情況，厚度為0.9—1.0mm的裁玻片是比較合適的。至于蓋玻片在第三章中已講過了，這里不再重復(fù)。