顯微鏡技術(shù)及其功能配置應(yīng)注意的問題

光學(xué)顯微鏡較為廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實驗室，隨著近代光學(xué)技術(shù)的發(fā)展及微電子、計算機(jī)等技術(shù)的融合，更賦予這一傳統(tǒng)儀器技術(shù)以新的生命力。在掌握必要的顯微鏡及其各種鏡檢方法的理論知識基礎(chǔ)上，精確進(jìn)行調(diào)試、校準(zhǔn)和定期維護(hù)，對保證顯微鏡技術(shù)的有效利用及觀測質(zhì)量甚為重要。

1 安裝與維護(hù)
安裝與維護(hù)是保證顯微鏡正常使用的基礎(chǔ)條件。顯微鏡應(yīng)安置在無塵、無振動、無化學(xué)腐蝕性暴露、無過度光投照散射、相對濕度低于60％的實驗室內(nèi)。無塵是安裝使用光學(xué)檢測儀器的特定要素，尤其是進(jìn)行暗場、DIC相差、熒光等鏡檢時。除要保持室內(nèi)清潔外，重在對顯微鏡施實時養(yǎng)護(hù)。清潔顯微鏡光學(xué)器件先可用吹氣風(fēng)球吹朔掉表面的灰塵顆粒，隨之用專用擦鏡紙蘸適量擦鏡液（******和乙醇7:3配制的混合液）由內(nèi)向外螺旋跟進(jìn)擦拭，而后用干紙擦，再用吹風(fēng)球吹干；對≥40×物鏡前透鏡要使用質(zhì)地較軟的木牙簽或類似物體磨鈍**包上至少兩層擦鏡紙蘸擦鏡液輕擦，不能用堅硬的竹牙簽，以免牙簽透過擦鏡紙劃傷透鏡面。使用油鏡后要立即濕擦兩次，同時檢查相鄰的其它倍率物鏡是否在轉(zhuǎn)換鏡頭時沾染上鏡油，如有一并擦拭之。但注意不是所有光學(xué)部件都可如此擦拭，對鍍有特殊光學(xué)涂層的偏光鏡檢的起偏鏡及檢偏鏡、DIC棱鏡、熒光激發(fā)發(fā)射濾光片組件等，平時要常用吹風(fēng)球吹朔，一旦沾染*好涂液態(tài)膠類物質(zhì)干后揭去粘除污染物。不能用有機(jī)溶劑（如高濃度酒精）擦拭鏡體。
無振動體現(xiàn)兩個涵義。一是安裝位置遠(yuǎn)離振動源，安裝臺面水平、穩(wěn)定、無振動，必要時配置專用防震臺，配套計算機(jī)*好不要與顯微鏡放在一個臺面上且兩臺間要留有空隙以免聯(lián)動。二是操作過程無振動，特別是在鏡像采集的曝光時間內(nèi)、顯微操作、顯微切割等精密環(huán)節(jié)。
除外熒光鏡檢，控制室內(nèi)的光照度和方向非常重要，照明要均勻避免過度炫光。光照不能刺激人眼，也不能直接投照顯微鏡的光路器件，把顯微鏡臨窗安置是不甚合適的。較長時間不用的可拆卸光學(xué)部件要放入干燥罐中保存，并定期更換吸潮劑。在濕度較高季節(jié)，室內(nèi)*好安裝除濕機(jī)并及時倒掉水箱內(nèi)的水。

2 調(diào)整與校正
主要是顯微鏡光學(xué)器件的調(diào)整、校準(zhǔn)及其光學(xué)參數(shù)設(shè)置。

2.1 照明光源燈絲對中
對沒有預(yù)定燈絲中心的顯微鏡需要在更換燈泡或搬動顯微鏡后進(jìn)行此項調(diào)節(jié)。方法是縮小視場光闌，在視場光闌處放置乳白磨砂濾光片或一塊硫酸紙，可看到燈絲像和縮為點狀的視場光闌像呈現(xiàn)。利用燈箱外方的三個調(diào)節(jié)螺桿進(jìn)行調(diào)節(jié)操作，其中一個調(diào)整燈泡的聚焦直到燈絲像清晰可見，如點狀視場光闌像不在燈絲中央，則用其它兩個螺桿做上下、左右調(diào)整，直到燈絲完全調(diào)至中央為止，見圖1。

2.2 聚光鏡光(合)軸調(diào)節(jié)
聚光鏡光軸偏移產(chǎn)生的問題是視場照明不均，因而此項操作要納入顯微鏡的定期校準(zhǔn)規(guī)程。在明場下，用10×物鏡觀察標(biāo)本并完成調(diào)焦；將視場光闌盡量縮小、聚光鏡孔徑光闌開至*大，在視場內(nèi)可見到視場光闌的輪廊像（視場光闌像不清晰，可稍微調(diào)節(jié)聚光鏡的升降螺旋)；如后者不在視場中央，則交替旋調(diào)聚光鏡外側(cè)的兩個調(diào)中螺桿將其調(diào)至中央部分，而后逐漸地開大視場光闌，能看到光闌向視場周緣均勻展開直至視場光闌的多角輪廓像完全與視場邊緣形成內(nèi)接，表明聚光鏡與顯微鏡光路達(dá)到合軸。合軸后再略微開大視場光闌，使輪廓像剛好處于視場外切或稍大一些，這樣即適于作鏡檢觀察，調(diào)節(jié)過程見圖2。注意不要忘記將聚光鏡升至原位，其透鏡距鏡臺平面0.1mm，焦點位于上方1.25mm處, 如聚光鏡低于此位將改變焦點并導(dǎo)致部分光斜照標(biāo)本產(chǎn)生過多衍射光影響分辨率。倒置顯微鏡要根據(jù)聚光鏡標(biāo)定的工作距離調(diào)節(jié)聚光鏡的位置，實際上當(dāng)用10×物鏡觀察到清晰的視場光闌時應(yīng)當(dāng)是合適的距離。

2.3 視場光闌調(diào)節(jié)
為獲得更好的鏡像反差，應(yīng)盡量屏蔽多余的雜散光進(jìn)入觀測鏡場或成像區(qū)域，在經(jīng)目鏡配合不同倍物鏡進(jìn)行觀測時，可調(diào)節(jié)視場光闌像對應(yīng)目鏡視場形成外切（圖3左）；在顯微攝影或數(shù)字CCD成像時，可根據(jù)取景框和CCD成像區(qū)域再適當(dāng)縮小視場光闌（圖3右），但不要縮過造成照片切角。使用油鏡時也可適當(dāng)縮小調(diào)節(jié)。

2.4 聚光鏡數(shù)值孔徑的設(shè)置
首先，配置聚光鏡的數(shù)值孔徑 (numeric aperture, NA) 范圍應(yīng)與物鏡的NA值基本相等，高倍細(xì)微鏡檢時有必要在頂端加油?？讖骄酃忡R的作用是對應(yīng)物鏡數(shù)值孔徑提供有效的聚焦投射光，如果設(shè)置聚光鏡的NA大于物鏡NA則一部分光浪費，而過小于物鏡NA投射光不足且由于出射角改變使一部分光斜照射標(biāo)本呈現(xiàn)衍射鏡像，兩者均會降低鏡像的分辨率。因此，應(yīng)遵循一定的對應(yīng)設(shè)置原則，經(jīng)驗值是鏡檢觀察時為80～100％，攝影時為獲得較合適的反差和景深建議設(shè)置在60～80％或70～80％。這意味著每轉(zhuǎn)換一種倍率的物鏡時，都要根據(jù)其NA對聚光鏡的NA做出對應(yīng)設(shè)置[2]，這樣才能保證鏡檢質(zhì)量，實際中還可根據(jù)標(biāo)本薄厚、染色深淺進(jìn)行細(xì)調(diào)。

2.5 覆蓋差校正
標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片厚度0.17mm、載玻片1.0mm，由于采用不符合標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片或載玻片加之切片、封片劑薄厚不均會產(chǎn)生覆蓋差，影響較大NA物鏡的鏡像質(zhì)量。為校正覆蓋差，在40×、60×或20×干系物鏡上設(shè)計有覆蓋差校正環(huán)(correction collar, CC)，校正范圍一般在0.11~0.23mm，長工作距離物鏡可至2.0mm。應(yīng)當(dāng)精細(xì)掌握CC的調(diào)節(jié)要領(lǐng)，不然反而會帶來麻煩，特別是當(dāng)前一個實驗者做了校正而下一個實驗者的樣片覆蓋差不一致時。方法是，先選調(diào)CC將0.17數(shù)值標(biāo)線對準(zhǔn)定位刻線，觀察鏡像是否能做到調(diào)焦清晰，如不很清晰則分別向左右方向旋調(diào)CC環(huán)直至鏡像達(dá)*佳，且要堅持每當(dāng)更換標(biāo)本時均應(yīng)完成覆蓋差校正調(diào)節(jié)才能保證鏡檢質(zhì)量。

2.6 光源電壓
目前鎢鹵燈透射光照明主要有6V/20W、6V/30W和12V/100W三種（50W燈源已少見），顯微鏡通過調(diào)節(jié)電壓控制其功率。在常規(guī)鏡檢，可根據(jù)標(biāo)本的薄厚、物像層次（對光的吸收情況）以及色溫來調(diào)設(shè)電壓值，如鏡像過亮刺眼可加中密度(neutral density, N或ND)濾光片。值得留意的是在顯微攝影時，需根據(jù)實際測得的色溫值調(diào)節(jié)電壓達(dá)到膠片所要求的色溫（如日光型膠片5,500～6,000K°或6,500K°，對應(yīng)電壓在9～12V），一旦設(shè)定則不能隨意再改變電壓，只能通過加ND濾光片調(diào)節(jié)而不影響色溫。

2.7 屈光度調(diào)節(jié)
此項操作很容易被忽略以致實驗者眼疲勞，實際上臨檢級顯微鏡的目鏡筒大多配置有屈光度調(diào)節(jié)機(jī)制。生產(chǎn)廠建議調(diào)節(jié)方法各異，但如果配置的物鏡齊焦常用操作步驟是，先調(diào)整好瞳距，用右側(cè)目鏡觀察完成對焦，而后改用左測目鏡觀察調(diào)節(jié)裝有的屈光度校正環(huán)直至調(diào)焦清晰；或先用40×物鏡完成鏡像對焦，再改用4×物鏡用左眼觀察，同時旋轉(zhuǎn)目鏡筒上的屈光度校正環(huán)，直到聚焦鏡像*佳。

2.8 常用鏡檢法的調(diào)置
重點討論以下鏡檢法操作過程中常易疏漏的調(diào)置環(huán)節(jié)。

2.8.1明場（bright field, BF）
定期進(jìn)行聚光鏡中心調(diào)整，實時進(jìn)行聚光鏡與物鏡NA的對應(yīng)數(shù)值調(diào)設(shè)。清潔蓋玻片、載玻片，確保沒有手印、沾染物。使用油鏡時，調(diào)焦或移動視野要慢些以維持浸油形成的表面張力保證對焦和孔鏡角穩(wěn)定，兼做熒光觀察的物鏡*好統(tǒng)一用無熒光油