徠卡顯微鏡FRET與FLIM定量在體內(nèi)生物化學(xué)
熒光壽命是多久熒光團(tuán)保留在平均在激發(fā)態(tài)通過發(fā)射熒光光子返回到基態(tài)之前的量度。它依賴于熒光團(tuán)的分子的組合物和納米環(huán)境。
FLIM結(jié)合壽命測量與成像：為每個圖像像素獲得的壽命是顏色編碼，以產(chǎn)生更多的圖像對比度。因此，F(xiàn)LIM有關(guān)其生化狀態(tài)或納米環(huán)境的信息提供關(guān)于熒光分子的空間分布的信息一起。FLIM的一個典型應(yīng)用是FLIM-FRET。FRET是一個行之有效的方法來研究分子間的相互作用。它審視蛋白結(jié)合，并估計在一個規(guī)模埃距離間也。
FRET - 原理
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）描述的能量存儲在激發(fā)的熒光分子（供體），以非激發(fā)不同的熒光分子（受體）在其附近的非輻射轉(zhuǎn)移。 三個條件必須滿足FRET發(fā)生：
圖1：供體（ECFP這里，藍(lán)線）的發(fā)射光譜必須與受體的激發(fā)光譜（這里EYFP，黃線）重疊。這個要求意味著兩個分子在FRET對具有兼容的能量水平。
圖2：供體分子（D）是通過從受體分子（A）的距離為r隔開。
圖3：在距離r小于閾值R 0，也稱為福斯特半徑大得多，沒有能量傳遞。
圖4：如果分子處于緊密接觸能量從激磁光子（藍(lán)色箭頭）被傳非輻射到受體。 反過來，后者發(fā)射光子（黃色箭頭）。 這個處理（E）的效率強烈地依賴距離為r -6。
影響
由于其隨r強距離相關(guān)-6（圖4）的FRET發(fā)生在一個空間尺度是用于生化反應(yīng)，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用高度相關(guān)。 FRET可以通過靈敏的熒光讀出探測分子間的相互作用。 這使得研究人員研究在體外和體內(nèi)分子間的相互作用。通過將與適宜的熒光標(biāo)記感興趣的兩個相互作用配偶能夠分析雙分子相互作用?？商娲?，F(xiàn)RET允許生物探針報告的第二信使或離子強度由分子內(nèi)FRET的手段濃度的結(jié)構(gòu)，由于強的構(gòu)象變化。
毫不奇怪，F(xiàn)RET已發(fā)展成為細(xì)胞生物學(xué)，生物物理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)成像廣泛使用的工具。
該方法
有不同的技術(shù)來檢測FRET在顯微鏡的情況下。俗稱的基礎(chǔ)上無論是供體（受體 - 漂白，F(xiàn)RET AB）或受體（致敏的排放，F(xiàn)RET SE）的熒光強度的技術(shù)。
基于強度的FRET可以使用標(biāo)準(zhǔn)共焦顯微鏡可以容易地應(yīng)用。 然而，它也有一些缺點。FRET AB不能在時間系列實驗被應(yīng)用并易受可逆漂白的供體分子或光轉(zhuǎn)化。FRET SE，另一方面，患有光譜串?dāng)_固有所有FRET對，需要仔細(xì)校準(zhǔn)測量以及產(chǎn)生的圖像的線性分解。 本申請書介紹了一種不同的方法來測量FRET是基于熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM）。
熒光壽命
熒光的過程常常被理解分子中（圖5，左）從電子基態(tài)（S 0）到激發(fā)態(tài)（S 1）項的能量轉(zhuǎn)換。這種轉(zhuǎn)變可以由入射光與適當(dāng)?shù)哪芰浚搭l率或波長）被引出。 所吸收的能量被熒光分子存儲短時間才可以發(fā)出熒光。一個分子在其激發(fā)態(tài)的時間被稱為熒光壽命。 它典型地在納秒（10 -9秒 ），用于許多有機染料和熒光壽命蛋白質(zhì)的順序。
熒光壽命和FRET
另一種方法，以放松從激發(fā)態(tài)是，例如，F(xiàn)RET。通過FRET激發(fā)能量是非輻射地轉(zhuǎn)移到受體分子。反過來接受器可以通過熒光（圖5，右）放松。 由于供體熒光和能量轉(zhuǎn)移是競爭過程的消耗率的激發(fā)態(tài)增加FRET的存在。有人可能會說，時間越長，供體分子度過處于興奮狀態(tài)就越有可能的是，F(xiàn)RET發(fā)生。 僅僅從供體分子的光子通過它放松熒光觀察。能量轉(zhuǎn)移到受體分子不因受體熒光的波長更長的檢測。 因此，F(xiàn)RET縮短壽命捐助（圖6）。
圖5：在FRET對能源的過渡。 光能匹配的供體分子的過渡被吸收（藍(lán)色箭頭）。 興奮的捐贈者可以放松或者通過熒光（灰色虛線箭頭，左）或共振能量轉(zhuǎn)移到受體分子（黑色箭頭）。
圖6：激發(fā)后繪制的熒光光子數(shù)在經(jīng)過時間。 激勵脈沖后發(fā)射的光子的初始數(shù)量，一個0，呈指數(shù)衰減。 熒光需要時間衰變到一個0 / E（?37％）是熒光壽命。 壽命τ轉(zhuǎn)移到更短的時間，由于FRET（τ淬火 ）。另一種讀出從壽命衰減幅度為0。在掃描系統(tǒng)中的每個位置測量的壽命產(chǎn)生壽命（見插圖）的空間地圖。
熒光壽命成像（FLIM）
使用脈沖激光器和單光子計數(shù)探測器在Leica TCS SMD系列測量在時域熒光壽命。壽命是通過建立檢測熒光事件的直方圖來確定。這揭示了一個單或多指數(shù)熒光衰減。 數(shù)值曲線擬合呈現(xiàn)熒光壽命和振幅（即，檢測到的光子數(shù)）。（
FLIM-FRET
由于FRET減少捐助壽命可以量化到FRET發(fā)生時，提供無FRET供體的壽命是已知的程度。這個供體壽命τ用作*參考針對其FRET樣品進(jìn)行了分析。 因此，F(xiàn)LIM-FRET是內(nèi)部校準(zhǔn) - 一個屬性減輕許多的基于強度的FRET測量的缺點。因為它的熒光壽命是一種染料的固有屬性是廣泛不變的，否則不利影響如漂白，圖像陰影，不同濃度或表達(dá)水平。
主要的使用限制強度基于FRET測量的基本假設(shè)所有觀察到的捐助分子發(fā)生FRET。這通常不是這樣的。 供體分子的這種變化的“綁定”部分介紹了相當(dāng)大的不確定性所測得的FRET效率，使實驗無法進(jìn)行比較。 FLIM-FRET克服了這一缺點。
拍攝使用活細(xì)胞圖像FLIM
如前面提到的，F(xiàn)RET效率從微動施主壽命τ 驟冷過的非微動壽命τ作為的比值來計算：
為此τ必須從測量使用包含施主只有一個樣品已知的。 它排除從受任何排放量是很重要的。 使用外部檢測器必須使用一個帶通濾波器。 內(nèi)部檢測器可被調(diào)節(jié)以只記錄供體發(fā)射。 相同的設(shè)置，必須同時用于donoronly測量以及使用FRET樣品的測定。
CFP-YFP FRET活細(xì)胞
在這項工作中，我們使用培養(yǎng)RBKB78細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染了熒光共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建體組成的CFP-YFP的融合蛋白質(zhì)（圖7）的。 兩個的FP通過兩個氨基酸的短的接頭連接。這樣的供體 - 受體融合也可以作為在真實的場景中一個很好的陽性對照FRET?！熬柚?的”樣本包括轉(zhuǎn)CFP只（圖7A）相同的細(xì)胞。 作為*近似的平均壽命是計算在快速FLIM的模式，對于兩個，只有供體和FRET樣品（圖7B）。壽命分布直方圖顯示，供體的平均壽命τ是2.1納秒（圖8）。在FRET結(jié)構(gòu)的供體的壽命是1.4納秒。 其中獲得一個FRET效率E = 1 - （1.4 / 2.1）= 33％。
頂行：圖7：RBKB78細(xì)胞轉(zhuǎn)染與CFP供體只（A）和CFP-YFP融合（B）。 該檢測范圍是使用光譜FLIM探測器設(shè)置445-495納米之間。 著色區(qū)域已被用于分析。 顏色代表調(diào)強熒光壽命。 禮貌教授格雷戈里·哈姆斯，維爾茨堡，德國的大學(xué)。 我們承認(rèn)實驗支持由本尼迪克特克萊默博士（Picoquant，柏林），揚 - 亨德里克Spille和WIEBKE巴克
下排：圖。 8：供體熒光壽命分布只（黃色），并使用平均壽命FRET（綠）的樣品。 還有就是0.7納秒對FRET樣品中壽命較短一個明顯轉(zhuǎn)變。
FRET的比例與無FRET
它是已知的CFP到具有至少兩個壽命部件在自己的權(quán)利。此外，它是不知道所研究的所有分子是否發(fā)生FRET先驗。為了公平對待這種復(fù)雜性人們需要對*過平均壽命的信息。我們可以進(jìn)行雙組分配合，這將給我們兩個人的壽命和兩個振幅。后者允許我們估計一個人一生中的相對比例比其他。 特別是，使用的振幅，我們可以估算該分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出FRET（結(jié)合級分）和未表現(xiàn)出FRET（未結(jié)合部分）的級分的相對比例。 fps的微弱第二部分，如EGFP或藍(lán)寶石非常適合這種類型的分析。