徠卡顯微鏡TIRF在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

TIRF顯微鏡的特殊特征是倏逝場的熒光激發(fā)就業(yè)。標(biāo)準(zhǔn)視場熒光照明與程序不同與弧燈、 發(fā)光二極管或激光器，倏逝場只有大約 100nm開始從蓋玻片/介質(zhì)界面滲透標(biāo)本。這允許"加法"光學(xué)切片的標(biāo)本，起價(jià)在非常高的軸向分辨率，蓋玻片，并為特定的應(yīng)用程序帶來幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

TIRF顯微鏡技術(shù)優(yōu)勢

TIRF 顯微鏡的一大優(yōu)勢是其*的信號(hào)噪聲比。由于低滲透深度的倏逝場，焦點(diǎn)出熒光減到*小，因此幾乎沒有任何背景熒光發(fā)生。因?yàn)橹挥胁糠謫卧癖┞对陔姶诺馁渴挪ǖ哪芰?，生產(chǎn)的有害的氧，因此細(xì)胞的光毒性應(yīng)力大大降低以及。這極大地提高細(xì)胞活力，并允許更長的試驗(yàn)時(shí)間。此外，水平較低的光漂白只發(fā)生在一個(gè)小區(qū)域的單元格。正從胞漿進(jìn)入這一地區(qū)的新熒光穩(wěn)定流量，信號(hào)噪聲比保持不變的一長段時(shí)間。此外，熒光適合 TIRF顯微鏡 （例如 EGFP，熒光 4 等） 的范圍較大，僅限于由可用激光線，以便活細(xì)胞成像技術(shù)，如煩惱、 FRAP、 鈣成像等都很容易執(zhí)行。光敏感攝像機(jī)的連接使高速圖像采集的觀察快速事件。此外，TIRF 顯微鏡可以結(jié)合其他微觀的技術(shù)，如免疫熒光顯微鏡和明視場對比方法。TIRF 顯微鏡的一個(gè)缺點(diǎn)是到目前為止只貼壁細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)，為扇區(qū)，例如，并非一般靠近倏逝波穿透試樣的蓋玻片/介質(zhì)界面。

TIRF顯微鏡在生命科學(xué)研究中

通過采用的熒光激發(fā)倏逝場空間受限，TIRF顯微鏡允許觀察定位及分子和附近等離子膜光學(xué)切片過程動(dòng)力學(xué) （通常大約 100 nm）。這是便于處理進(jìn)程處于或接近細(xì)胞質(zhì)膜的許多應(yīng)用程序。

TIRF顯微鏡是一種*技術(shù)結(jié)合現(xiàn)場樣品中或甚至在體外與空間信息的動(dòng)力學(xué)研究。它經(jīng)常用于調(diào)查分子販賣它如發(fā)生在細(xì)胞骨架程序集?？焖賵D像采集和杰出的背景消除在 TIRF 顯微鏡提供精湛的觀測動(dòng)態(tài)事件像質(zhì)膜蛋白的招聘條件。因此，動(dòng)力蛋白/驅(qū)動(dòng)蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)可以追究，舉個(gè)例子。它也是能夠跟蹤整個(gè)的細(xì)胞器，如線粒體利用 TIRF顯微鏡。在細(xì)胞間相互作用進(jìn)行調(diào)查，像細(xì)胞粘著的特殊結(jié)構(gòu)很容易可以被可視化與 TIRF 顯微鏡觀察例如招募到粘著斑骨架零件。

*的信號(hào)噪聲比和 z 決議的 TIRF 顯微鏡相結(jié)合 （例如形心跟蹤方法） 的數(shù)學(xué)模型，由subdiffraction 有限公司定位的單分子是可以實(shí)現(xiàn)的精度為 1 nm。這是視圖的樣品的可能的如由倏逝波的熒光激發(fā)產(chǎn)生低背景熒光從焦點(diǎn)出熒光，導(dǎo)致低信號(hào)-到-信噪比 （如乘以字段的區(qū)域中的倏逝波的穿透深度） 定義卷中。在傳統(tǒng)的基于 lamp 的熒光系統(tǒng)將興奮并同時(shí)所有熒光束路徑中的，然后將其檢測到?jīng)]有任何有關(guān)他們的 z位置的信息。(奧林巴斯顯微鏡)

換句話說： 三個(gè)三維空間分布的熒光顯示在只有兩個(gè)維度，如不同的 z 平面的單元格顯示為一個(gè)平面中獲取的圖像。這將導(dǎo)致在堆焊熒光在圖像中，往往使得單個(gè)熒光斑點(diǎn)的歧視是不可能。在 TIRF 顯微鏡，只有大約 100 nm深倏逝波內(nèi)熒光相對較小數(shù)目然而，被激動(dòng)，提供樣品光學(xué) z 段。

TIRF 圖像在 x 和 y 方向的熒光斑點(diǎn)的空間距離是相對較低的因?yàn)閺钠渌?z 平面熒光發(fā)射的光不疊加的檢測到的信號(hào)。然后應(yīng)用數(shù)學(xué)模型 （例如形心跟蹤方法） 來計(jì)算檢測到的熒光分子的重心，subdiffraction 有限公司定位的單分子是否可行且精度為 1 nm。

圖 1： 視場圖像的微管蛋白表達(dá) YFP                                                圖 2： YFP，微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度： 120 毫米

圖 3： YFP，微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度： 90 毫米                                    圖 4： YFP，微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度： 70 毫米

另一大 TIRF 顯微鏡領(lǐng)域是應(yīng)用的如囊泡膜融合過程的考試。倏逝波只激發(fā)熒光靠近細(xì)胞膜，正，可能要監(jiān)視吞囊泡的形成和分泌囊泡與質(zhì)膜的融合。為此目的，可以通過標(biāo)記胞貨物蛋白質(zhì)的熒光蛋白質(zhì)，像綠色熒光蛋白標(biāo)記囊泡。

由于光學(xué)切片，它有可能以解釋熒光強(qiáng)度作為熒光標(biāo)記囊泡運(yùn)動(dòng)進(jìn)入或離開倏逝場或作為貨物釋放或吸收的變化。在強(qiáng)度相當(dāng)緩慢的增益將意味著運(yùn)動(dòng)到倏逝場，因而對細(xì)胞膜的議案。后的分泌囊泡與細(xì)胞膜融合，熒光信號(hào)迅速減小，當(dāng)貨物被釋放到細(xì)胞外空間。反之亦然，可以通過使用熒光底物觀測細(xì)胞內(nèi)吞作用喜歡標(biāo)記的葡聚糖，被吞過程中的單元格。

另一個(gè)重要的過程發(fā)生在細(xì)胞膜是細(xì)胞信號(hào)（如信號(hào)的 G 蛋白偶聯(lián)受體）。這里如招聘或運(yùn)動(dòng)中信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的單分子 （例如 G 蛋白） 是可以觀察的。

圖 5： 視場圖像的 Galectin3 表達(dá) YFP                                  圖 6： TIRF 形象的 Galectin3 YFP

所有圖像： 禮貌的教授、 博士 R.雅各、 大學(xué)馬爾堡、 臨床生物學(xué)部和細(xì)胞病理學(xué)，馬爾堡，德國