尼康顯微鏡熒光濾光片原理

什么是落射熒光顯微鏡

熒光團(tuán)

熒光現(xiàn)象發(fā)生在特定波長(zhǎng)的光（激發(fā)光）被物質(zhì)吸收時(shí)，當(dāng)物質(zhì)從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，它釋放出能量時(shí)發(fā)出光。許多熒光物質(zhì)（稱為熒光團(tuán)）已被開發(fā)用于不同的用途，激發(fā)波長(zhǎng)范圍從紫外到紅外。然而，發(fā)射波長(zhǎng)通常比引起它們的激發(fā)能量的波長(zhǎng)長(zhǎng)。

落射熒光顯微鏡

落射熒光顯微鏡是指設(shè)計(jì)用于觀察上述熒光團(tuán)的顯微鏡。光學(xué)系統(tǒng)包含用于激發(fā)的光源（通常為汞燈）和用于將激發(fā)光與熒光分離的濾光器塊。有許多過濾塊可用于不同類型的熒光基團(tuán)，可隨時(shí)切換連續(xù)觀察多種熒光染料的標(biāo)本。

激發(fā)塊在外熒光顯微鏡中的作用

如圖1所示，激發(fā)塊由兩種過濾器和一個(gè)分色鏡構(gòu)成。選擇適當(dāng)?shù)倪^濾器和鏡子，使研究人員能夠獲得熒光和背景光之間的高信噪比（S / N）。以下描述這些光學(xué)元件的功能。

激發(fā)濾波器（EX）

激發(fā)濾波器是僅使從激發(fā)光源（通常為汞燈）激發(fā)所需的光的波長(zhǎng)通過到熒光團(tuán)的光學(xué)元件。如圖2所示，只有激發(fā)波長(zhǎng)通過濾波器，通常是一個(gè)“帶通濾波器”。

分色鏡（DM）

二向色鏡是將激發(fā)光與熒光分開的光學(xué)元件。分色鏡是特殊的反射鏡，僅反射特定波長(zhǎng)的光，允許所有其他波長(zhǎng)通過（圖3）。落射熒光顯微鏡濾光片塊中使用的分色鏡以45°的入射角照射光，形成反射光的“阻帶”和透射光的“帶通”。通過激發(fā)濾光片的光線被90°反射到物鏡和樣品上。*后，從樣本發(fā)出的光線通過并指向觀察者（或高靈敏度相機(jī)）。

屏障濾波器（BA）或發(fā)射（EM）濾波器

屏障過濾器是將熒光發(fā)出的熒光與其他背景光分開的光學(xué)元件。如圖4所示，屏障濾光器透射通過分色鏡的熒光波長(zhǎng)的光，同時(shí)阻擋從激發(fā)燈泄漏的所有其它光（從樣本或光學(xué)元件反射）。這是必要的，因?yàn)闊晒鉄舻膹?qiáng)度比激發(fā)光弱100,000倍以上。大多數(shù)屏障過濾器被放置在一個(gè)很小的角度，以通過抑制重影圖像來實(shí)現(xiàn)更好的熒光成像。

尼康的噪音終結(jié)者

尼康的落射熒光顯微鏡有專有的尼康光學(xué)元件，被稱為“噪音終結(jié)器”（型號(hào)TE2000及更高版本）。如圖1所示，噪聲終止器允許通過防止激發(fā)光在濾光片塊內(nèi)散射并泄漏到觀察圖像中而有效地處理透過分色鏡的光。這有助于消除背景光噪音和更有效的熒光圖像。

選擇熒光過濾器和鏡子

選擇熒光濾光片和反射鏡時(shí)應(yīng)遵循以下步驟。

熒光團(tuán)（熒光物質(zhì)）的波長(zhǎng)

確定使用的熒光團(tuán)的波長(zhǎng)。這些信息在目錄中有記載，但熒光基團(tuán)的波長(zhǎng)特性也會(huì)根據(jù)溶液條件（如鹽度，pH值和細(xì)胞內(nèi)條件）而稍有變化。因此，我們建議使用熒光計(jì)來測(cè)量激發(fā)和熒光波長(zhǎng)。然后，使用這些信息來選擇*合適的光學(xué)元件。

分色鏡選擇

選擇的分色鏡必須有效地分離激發(fā)光和熒光的波長(zhǎng)。具體而言，必須通過將反射鏡放置在45°入射角時(shí)將反射鏡的特性曲線與熒光團(tuán)的波長(zhǎng)進(jìn)行比較來找到透射率截止在熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)與其熒光波長(zhǎng)之間的二向色鏡。

如果熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)接近，斯托克（Stoke）位移（注1）較小，則應(yīng)選擇截止波長(zhǎng)較小的反射鏡，以盡可能多地使熒光信號(hào)通過。

屏障過濾器選擇

選擇一個(gè)允許樣品熒光波長(zhǎng)通過的過濾器。通常，在帶通濾波器上選擇傳輸長(zhǎng)波長(zhǎng)的長(zhǎng)通濾波器。然而，當(dāng)從多重染色的樣本分離波長(zhǎng)時(shí)，或者當(dāng)使用對(duì)較長(zhǎng)波長(zhǎng)敏感的相機(jī)時(shí)，不傳輸這些較長(zhǎng)波長(zhǎng)的帶通濾波器通常用作屏障濾波器。

激發(fā)濾波器選擇

選擇一個(gè)允許激發(fā)波長(zhǎng)平穩(wěn)通過的濾波器。尤其是當(dāng)使用汞燈作為光源時(shí)，通過將汞燈的線譜結(jié)合到波長(zhǎng)中來實(shí)現(xiàn)有效的激發(fā)。允許除物鏡熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)之外的波長(zhǎng)通過將增加背景光并破壞樣品。如圖7所示，對(duì)于440nm的波長(zhǎng)，激發(fā)效率較低。

屏障濾波器和激發(fā)濾波器的組合

屏障濾光片和激發(fā)濾光片的理想組合是一種不讓光線通過的組合。發(fā)出的熒光非常弱，所以任何通過濾光片泄漏的光都會(huì)降低圖像質(zhì)量。

獲得明亮的熒光圖像

有時(shí)建議去除激發(fā)光學(xué)中的ND濾光片，并增加激發(fā)光源的強(qiáng)度。然而，增加激發(fā)光源的強(qiáng)度會(huì)使熒光團(tuán)快速漂白并損壞樣品，并增加電池中的自發(fā)熒光（注2）。由于這些原因，光源應(yīng)該盡可能地弱，并且觀察光學(xué)器件盡可能高效地拾取熒光信號(hào)（通過擴(kuò)大目標(biāo)孔徑，增加熒光濾波器的波段，使用更靈敏的相機(jī)等）。

[注1]斯托克變換是指激發(fā)能量與熒光能量之間的能量差異，因能量在熱熒光材料中從激發(fā)態(tài)回落到其基態(tài)時(shí)的熱能部分損失而產(chǎn)生。（巖波書店理化辭典）

[注2]自發(fā)熒光是指熒光物質(zhì)在除熒光物質(zhì)以外的物質(zhì)中的存在。例如，細(xì)胞成分如NAADPH或核黃素在未染色的細(xì)胞中在短波長(zhǎng)范圍（紫外至可見光）中發(fā)出相對(duì)較強(qiáng)的熒光。

減少漂白

您可以采取以下步驟來減少漂白。

使用抗漂白劑

對(duì)苯二胺等防漂劑可用于FITC，羅丹明可用正丙基鎵。

使用ND濾鏡

在顯微鏡上使用中性密度或ND濾光片，將光線水平降低到觀察所需的*低水平。有時(shí)這可能需要將濾波器設(shè)置為100％，同時(shí)采取措施盡可能不分割光路。

使用抗漂白熒光團(tuán)

使用可用于每個(gè)測(cè)試目的的*漂白的熒光團(tuán)。