奧林巴斯顯微鏡聲光可調(diào)諧濾波器（AOTFs）

 光電技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡的整合提供了一個顯著增強的光譜控制適用于各種各樣的熒光研究。聲光可調(diào)諧濾波器（OTF）是一種光學裝置的功能作為一個電子可調(diào)諧激發(fā)濾光片同時調(diào)節(jié)強度和從一個或多個源的多波長激光線。這種類型的設備，依靠專業(yè)的雙折射晶體的光學特性的變化的相互作用時的聲波。在聲波頻率的變化改變了晶體的衍射特性，能夠非常快速的波長調(diào)諧，只有聲運輸時間在水晶有限公司。

聲光可調(diào)諧濾波器設計的顯微鏡通常由一個二氧化碲或石英晶體的壓電換能器結(jié)合。響應于振蕩射頻應用（射頻）電氣信號，變頻器產(chǎn)生的高頻振動（聲波）波傳播到的晶體。交變超聲聲波引起的折射率的周期性分布通過晶體作為透射衍射光柵或布拉格diffracter偏離入射光的一部分轉(zhuǎn)化為一階光束，它是利用顯微鏡（或二階梁當入射光非偏振光；見圖1）。改變施加到晶體傳感器信號的頻率改變折射率的變化，周期，因此，光的波長，衍射。衍射光束的相對強度的振幅決定（功率）應用于晶體的信號。

在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的配置，包括許多共焦系統(tǒng)，光譜的激發(fā)和發(fā)射光的濾波是通過利用薄膜干涉濾光片。這些過濾器是在幾個方面的限制。因為每個過濾器具有固定的中心波長和通帶，幾個過濾器必須被用來提供多光譜成像單色照明，以及衰減的強度控制的光束，和過濾器通常是由一個旋轉(zhuǎn)炮塔機械互換機制。干涉濾光片炮塔和車輪的有限波長的選擇，振動速度較慢的缺點，開關，和潛在的形象轉(zhuǎn)換。他們也很容易損壞的熱暴露，引起濕度，和強烈的照明，其光譜特性隨時間變化。此外，過濾器輪利用照明波長的選擇變得日益復雜和昂貴的激光被雇用人數(shù)與當前的應用增加了。

旋轉(zhuǎn)的濾光輪和光學塊炮塔介紹機械振動轉(zhuǎn)換成的成像和照明系統(tǒng)，因此需要大概50毫秒的阻尼時間延遲，即使濾波器過渡本身可以更迅速。典型的過濾器更換時間大大慢于實踐，然而，范圍在0.1到0.5秒。在旋轉(zhuǎn)機構(gòu)的機械不精確配準誤差時，可以引入順序獲取的彩色圖像進行處理。此外，固定的頻譜特性的干擾過濾器不允許不同的熒光團的組合優(yōu)化，也不適應新的熒光染料，限制的激發(fā)和檢測的顯微鏡功能的通用性。的聲光可調(diào)諧濾波器，共焦系統(tǒng)介紹克服的濾光輪缺點使快速電子調(diào)諧和從幾個激光器多條激光線的強度控制。

AOTF操作的基本原理

聲光晶體被定義為是聲波的存在改變的光學特性。當聲波傳播通過這樣的材料，晶格結(jié)構(gòu)交替壓縮和響應于振蕩波前放松。負責本聲光互作用的基本機制是眾所周知的光彈功效在整個晶體的晶格壓縮和稀疏的區(qū)域，表現(xiàn)為周期性的折射率的波動可以產(chǎn)生入射光的衍射。雖然聲光可調(diào)諧濾波器的功能類似于一個衍射光柵，它的行為是不同的，發(fā)生在一個擴展的衍射晶體的體積而不是在一個平面上，只有有限的頻帶的光譜頻率的影響。在這方面，AOTF執(zhí)行更多的作為一個帶通濾波器比衍射光柵。傳播的聲波產(chǎn)生的整個晶體的折射率的周期性調(diào)制，有效地產(chǎn)生一個移動的相位光柵，將部分的入射光，滿足適當?shù)南辔黄ヅ溲苌洌ɑ騽恿科ヅ洌l件。對于一個特定的聲波頻率，只有一個有限的范圍內(nèi)（帶）的光譜頻率滿足相位匹配條件，并成為衍射。不同的射頻驅(qū)動壓電換能器的變化的光譜通帶的中心，所需保持的相位匹配條件。選擇適當?shù)尿?qū)動頻率可以被調(diào)諧到不同的晶體衍射的特定波長帶，然后退出晶體在相對一個獨特的角度對衍射光束。

衍射波長（S）作為一種應用于晶體無線電頻率信號的功能變化。對于一組特定的AOTF設計參數(shù)（包括晶體材料和幾何），中心波長（λ）的通帶是由相位匹配確定（和動量匹配條件由以下方程定義）：

在前面的方程，V是聲波速度，Δn具有聲光晶體的雙折射，和F是聲波頻率。光波衍射光束傳輸?shù)恼穹菓糜诰w的射頻功率成比例的。因此，不同的RF信號的頻率和功率提供了一種機制，用于選擇光的AOTF濾波波長和強度。

在配置中的相互作用的聲學和光學波的初始AOTF設計中心共線，如圖2所示。在本設計中，聲波發(fā)射沿晶體的主軸線，與入射光束通過偏振器和沿晶軸相同的傳播路徑，與聲波共線相互作用（圖2）。光譜波長的窄帶光為偏振方向的入射光束正交的，并且可以通過輸出偏振器從耦合共線光束分離（分析儀分光器圖2）。如前所述，通帶的中心波長的相位匹配條件，存在光和射頻信號頻率之間的確定。

的共線AOTF幾何限制使用一個類的有限的晶體，而不幸的是，不包括一些最有效的聲光材料。為了充分利用的好處，如二氧化碲材料，并利用幾何是簡單的制造，配置中的聲學和光學波非共線開發(fā)（圖1）。在本設計中，窄帶和寬帶光的衍射光入射是分開的，因為他們退出晶體偏振器通過不同的途徑，不需要操作。零級衍射光束可以由一個光束阻擋阻擋，而過濾的衍射光束被用于標本照明。這種現(xiàn)象稱為聲走如圖1所示的聲群速度和聲學波法線之間的角度差，方差，是許多聲光器件常見。在一個共線AOTF配置的意義（圖2），雖然光線的傳播方向與聲波的相速度是由定義的共線，由此產(chǎn)生的聲波的群速度如下一個稍微不同的角度。

當非偏振光入射光束在非共線配置（描述為一個集中的光錐，圖1），光束的衍射部分包括兩個空間分離的一階光束，正交極化的。如果輸入光束的AOTF為線偏振光（如用激光源），只有一個衍射光束退出裝置，其偏振狀態(tài)旋轉(zhuǎn)90度相對于輸入偏振軸。因為兩個正交極化階梁不分開，直到他們離開的晶體，然后在一個固定的角發(fā)散，衍射角（和由此產(chǎn)生的圖像的空間位置）不隨波長。在應用中，利用非共線AOTF作為可調(diào)諧濾波器，一級衍射分量允許照射樣品（通常只有一個衍射輸出被使用），而零階光束受阻。兩個光束是由幾度分開，這是一個功能的裝置的設計。利用晶體具有較大的雙折射值，這偏轉(zhuǎn)角度（角分離的衍射和衍射光束）的增加，實現(xiàn)之間的衍射和衍射光束的偏振片充分的分離不使用一個理想的屬性。由衍射光束被偏轉(zhuǎn)角度至少為二氧化碲晶體系統(tǒng)時，光束入射角是平行的110。軸（在90度到光軸），并增加了8和9度的相對于[ 110 ]軸入射角的增加之間的實際的限制。偏轉(zhuǎn)角度之間發(fā)生的衍射和衍射光束后留下的晶體具有以下關系對晶體材料的雙折射：

在上面的表達式中，θ（i）和θ（d）是角度，相對于所述光學軸，入射和衍射光束，分別的。雙折射是由的Δn表示。基于操作的共線模式AOTF設備，如那些使用石英作為雙折射材料，可以被認為是共線設計的簡化的變異與入射角，θ（i）中，90度，和一個零偏轉(zhuǎn)角。

雖然原則上，各向同性和各向異性的布拉格衍射圖案可以利用的光譜過濾機制，一個關鍵的限制存在于各向同性過濾介質(zhì)的使用，因為光譜通帶的光入射孔徑角的變化，因此良好的準直光束是必不可少的。角孔徑對通帶特性的事實，在入射角的變化產(chǎn)生的動量不匹配結(jié)果的影響，導致衍射光束被偏轉(zhuǎn)不同波長。一個發(fā)散光束，光學通帶寬度對準直光束，急劇增加，嚴重限制了該濾波器的實際孔徑角。

各向異性的聲光濾波器具有一個很窄的通帶可以在一個大范圍的入射光束的角度保持實際優(yōu)勢。有了這個設計，衍射光束的偏振面旋轉(zhuǎn)90度的相對衍射光束的偏振方向。因為一般在雙折射晶體的光折射率的不平等和非凡的經(jīng)歷，聲波傳播方向可選擇的事件引起的群速度和衍射光是共線（下簡稱非臨界相位匹配）。在這種情況下，由入射光束的角動量失配的變化產(chǎn)生的最大雙折射角變化引起的偏移量。由于非臨界相位匹配條件被滿足在一個大范圍的入射光束的角度，對非共線AOTF的視場角是比較高的，同時保持理想的特性，如窄通帶。

對AOTF的制作材料

在近年來的應用利用聲光器件的數(shù)量顯著增加，主要是由于其制造材料的改進的發(fā)生發(fā)展。一個適當?shù)牟牧系倪x擇取決于特定設備的目標函數(shù)。例如，磷化鎵具有寬帶聲光偏轉(zhuǎn)器和調(diào)制器的建設的優(yōu)良特性，但由于其晶體結(jié)構(gòu)是光學各向同性的，材料是不適合的可調(diào)諧濾波器裝置。具體的一般要求，然而，適用于任何類型的光學裝置，其中包括高透光率在波長范圍加以利用，在足夠大的單晶體的可用性，合理的費用，除其他因素。評估材料的性能是一個因素，稱為聲光的一個有用的變量圖的優(yōu)點適當?shù)亩x，為特定的設備類型。文獻提出了至少五種不同的表達式計算圖的優(yōu)點，采用變量視為特定的設備功能相關。參數(shù)通常被認為是包括的折射率，密度指數(shù)，聲波速度，帶寬，分辨率（通過各種方法定義的），以及一系列的彈光系數(shù)。必須在AOTF設計優(yōu)化的具體變量衍射效率，波長分辨率，和立體角孔徑。無論該方程用于計算，任何數(shù)字的優(yōu)點是一般表示為無量綱值歸一化到適當確定的絕對值為石英。

基于它的許多良好的性質(zhì)，以及由此產(chǎn)生的高氧化碲聲光圖的優(yōu)點，是目前首選的AOTF的材料。首次報道在非共線AOTF操作模式試驗示范使用在可見光譜區(qū)中碲晶體進行操作。所描述的裝置是可調(diào)諧輸出波長范圍700至450納米（通帶中心）從100至180兆赫的射頻驅(qū)動頻率的變化。過濾后的光束相對于入射光束的衍射角為6度，近百分之100的入射光被衍射在120毫瓦的功率驅(qū)動。

二氧化碲是官能在整個可見光譜并進入紅外高達約5.5微米的波長，并且具有短的波長傳輸截止在約350納米。為了給AOTF可使用的范圍延伸到遠紫外線或進一步到紅外線，另一種材料必須采用。的二氧化碲設備的初始發(fā)展后，晶狀石英被用來擴大工作范圍到紫外線，并進一步延伸到紅外區(qū)域已經(jīng)完成與*** - 砷 - 硒結(jié)晶。擴大的光譜范圍可達到與AOTFs主要是由執(zhí)行有效的材料的可用性和在所期望的波長波段的高透明性的限制。

如前面所討論的，因為適合于共線AOTF的操作模式晶體類的有限數(shù)目的，顯著更多的努力已集中于開發(fā)材料的非共線的設備。性能規(guī)范文獻中報道的用于非共線AOTFs采用各種材料，包括二氧化碲，***，砷，硒，和*********在紅外線操作（高達約11微米的波長）。 AOTFs用于調(diào)諧在紫外光譜區(qū)已制作由結(jié)晶石英，氟化鎂，和藍寶石（氧化鋁）。水晶是用于操作在紫外區(qū)的優(yōu)選材料。因為優(yōu)點為石英的聲光數(shù)字僅為約0.002的二氧化碲，石英系AOTFs具有較低的衍射效率進行，并且需要較高的或許10倍的功率值來驅(qū)動射頻換能器，在比較二氧化碲濾波器。

AOTF的功能特點

最常用的AOTF設計用于在成像系統(tǒng)中的頻譜控制是基于在非共線方式操作二氧化碲，并且它因此考慮該設備的某些操作特性，這涉及到它的典型應用是有用的。 AOTF的波長調(diào)諧特性是最重要的，最常見的這些應用。動量（和相位）匹配條件規(guī)定，選擇用于衍射的波長是由施加到聲換能器和所得到的聲波頻率的驅(qū)動頻率來確定。圖3示出一個典型的調(diào)諧曲線為二氧化碲的非共線的AOTF在可見光到近紅外光譜范圍內(nèi)。選定的波長和施加RF頻率之間的調(diào)諧關系對兩個正交極化的輸出光束一般是不同的，并且每個的特征在于，一個單獨的數(shù)學表達式。隨聲波頻率的透射中心波長減小。的頻率和調(diào)諧波長變化的近似逆的方式，雖然這是不準確的，由于這一事實，即折射率為正常和非常光線的比例也隨波長而變化。這兩個輸出光之間的波長差，從幾納米變化到幾十納米，這取決于設備的配置。相關設計參數(shù)確定的AOTF晶體調(diào)諧關系是聲波傳播中，相對于[110]軸與入射光的輸入相對于所述光軸的，典型地被指定為α，θ（i）的角度，分別為。對這些設備的角度的一些組合中，如果入射光被偏振，只有一個偏振分量滿足非臨界相位匹配條件，而其他表現(xiàn)出與入射光束的角度調(diào)諧的關系的變化。

聲光可調(diào)諧濾波器是由壓電換能器，它通常是一個八度或更低的電 - 聲帶寬在其波長調(diào)諧范圍的限制。這個值是顯著小于調(diào)諧晶體的光傳輸范圍，并且一些可商購的AOTFs設置有多個換能器，被設計為不同的帶寬，增加的可調(diào)波長范圍內(nèi)。 AOTF的極其快速的調(diào)諧速度是其主要優(yōu)點為在顯微鏡的照明控制之一，并且該屬性僅由彈性波的渡越時間的晶體（相當于中轉(zhuǎn)距離由聲速除以）中限定。在非共線裝置中，聲波傳播距離是名義上等于所述光學孔徑。雖然較高的聲速對應更大的調(diào)諧速度，一些材料的衍射效率，包括二氧化碲，變化為音速的立方成反比。因此，較低的聲波速度規(guī)范可有利地用于器件如AOTFs。為二氧化碲，縱波沿<001>方向上傳播的具有每秒超過400公里的速度，而與此相反，傳播平行于<110>剪力波以每秒約617米異常低的速度行駛。這種AOTF在此“慢剪切模式”操作提供了改進的衍射效率，同時還顯示出小于10微秒調(diào)諧的響應時間。調(diào)諧速度為這種設計范圍從幾微秒至幾十取決于孔徑大?。暡▊鞑サ木嚯x）和其它的配置屬性，微秒的典型AOTFs如換能器和其上的晶體放置的特性。

AOTF的波長切換功能可以被用來提供一種快速可調(diào)光源，其可以在多種模式下，都適用于光學顯微鏡下操作。單一照明波長可以按順序被調(diào)諧或隨機訪問，并且能夠同時從所述濾波器輸出的多個波長。不同于傳統(tǒng)的衍射光柵或棱鏡，交換可以馬上隨機指定波長之間進行不掃描通過中間波長。每個調(diào)諧的波長通過電子方式切換到對應的RF驅(qū)動頻率定向到該裝置的輸出。如果一個以上的射頻驅(qū)動頻率被施加到壓電換能器，該傳播可變聲波能夠同時衍射多種光波長。無線電頻率驅(qū)動換能器的數(shù)目和相對功率可以迅速變化，以控制所發(fā)射的光的強度和波長。可同時使用的頻率的數(shù)量是由壓電換能器的功率處理能力來確定，并且通過滿足必要為每個衍射波長的最小功率時的總驅(qū)動力的無線電頻率被應用之間進行分配的要求?；诜枪簿€二氧化碲配置市售AOTFs，在可見光和近紅外光譜范圍內(nèi)工作，通常限制在10至12個同時的輸出通道。以繼續(xù)在低功耗AOTFs的發(fā)展技術(shù)的進步，可以預測，超過100個可控制的通道將能夠與即將到來的設備。

一個可調(diào)諧濾光器的光譜分辨率的定義是在一半最大值處從所選擇的光輸出的主瓣的整個寬度，并且是兩個波長和設備的配置的功能。一個典型的AOTF的范圍從幾納米的分辨率（帶通）到幾十納米的可見光和近紅外光譜區(qū)，約三十分之一的普通布喇格衍射的值。影響分辨率的設計參數(shù)包括結(jié)晶材料的分散常數(shù)（與雙折射的程度），則入射角，并且聲光相互作用長度。

根據(jù)目前的理論理事AOTFs的調(diào)諧特性，具有波長正好滿足相位匹配條件僅光源的衍射光束（S）中被發(fā)送，對于具有無限大的聲光相互作用長度的裝置。然而在實踐中，有限的相互作用長度的結(jié)果，在濾波器的通帶，它定義了設備的光譜分辨率的擴大。相反，衍射光柵，在一半最大值處的AOTF的透射峰的變化，因為波長的平方的函數(shù)的整個寬度，從而產(chǎn)生可變的帶通。掃描時，在整個波長調(diào)諧范圍，典型的AOTF可見光譜區(qū)域內(nèi)運行呈現(xiàn)出帶通規(guī)范的變化大約2?6納米。

在非共線的AOTF設計的，如前面所討論的，所施加的RF頻率和衍射的波長之間的調(diào)諧關系對兩個正交極化的一階光束不同。因此，他們的波長是不同的，只有一個符合非臨界相位匹配條件，這是可取的，以便最大限度地考慮到設備的視場角。在一些需要從AOTF增加輸出強度的應用中，有利的是利用結(jié)合衍射輸出。雖然有可能用標準的AOTF選擇輸入入射角相對于固定的晶軸與聲傳播方向而導致在這兩個偏振光束的等效調(diào)諧關系的，這種策略減少了光譜分辨率。特殊用途的二氧化非共線AOTFs碲也已制成具有專門選擇，以產(chǎn)生具有相同的調(diào)諧關系衍射輸出的設計參數(shù)，并與兩個滿足在近紅外光譜區(qū)的非臨界相位匹配條件。

作為施加于激光掃描共聚焦顯微鏡中，AOTF的最顯著優(yōu)點之一是它的能力來代替更為復雜和笨重的過濾機制，用于控制光的傳輸，并施加強度調(diào)制的波長鑒別的目的。執(zhí)行中的衍射光束的強度和波長極其快速調(diào)整的能力使AOTF獨特的控制能力。通過改變在不同波長的照射強度，多個熒光團的反應，例如，可以實現(xiàn)最佳的檢測和記錄均衡。另外，隨著相位和頻率鎖定技術(shù)的數(shù)字信號處理器可以被用來從多個熒光團區(qū)分發(fā)射或從背景中提取的低電平信號。

利用一個聲光可調(diào)諧濾波器，用于共焦顯微鏡的實用光源配置方案被示于圖4中三個激光系統(tǒng)（氦 - 鎘，氬氣和氬氪氣）的輸出被二色反射鏡通過AOTF合并，并指示其中所述第一級衍射束（綠色）是共線的，并且發(fā)射到單模光纖。的非衍射的激光束（綠色，黃色和紅色）退出的AOTF以不同的角度和由波束停止吸收（未示出）。由每個激光產(chǎn)生的主要線（波長）來表示（單位為納米）下的熱和冷鏡。二色鏡反射的波長比525納米的低，發(fā)射波長更長。通過氬 - 氪激光器（568）和（648納米）的產(chǎn)生兩個較長波長的線由熱反射鏡反射，而氬激光（458，476，488，和514納米）的輸出被二色反射鏡反射，并結(jié)合與來自氬 - 氪激光器所發(fā)射的光。從氦 - 鎘激光（442納米）的輸出由冷鏡反射的和結(jié)合的較長的波長從其他兩個激光器，它通過反射鏡發(fā)射。

因為從AOTF晶體的聲學換能器的快速光響應的，聲光相互作用是受突然的轉(zhuǎn)變類似于一個矩形，而不是正弦波形。這導致在旁瓣中的中央透射峰的任一側(cè)上的聲光可調(diào)濾波器的通帶的發(fā)生。在理想的聲 - 光條件下，這些旁瓣應當是對稱的左右中央峰，與具有中央峰的強度為4.7％的第一葉。在實踐中，旁瓣通常是不對稱的，并表現(xiàn)出從預測的結(jié)構(gòu)等的偏差，在聲光相互作用引起的變化，以及其他因素。為了減少在通帶內(nèi)，以不顯著水平的副瓣，多種類型的彈性波的振幅變跡都采用，包括各種窗函數(shù)，已發(fā)現(xiàn)30到40分貝抑制的最高旁瓣?？稍跍p少與非共線AOTFs旁瓣電平的可使用的一種方法是通過對換能器的加權(quán)激勵的手段來應用空間變跡。在共線聲光濾波器，采用不同的方法已經(jīng)被使用，它引入了一個聲脈沖，變跡的時候，進入過濾結(jié)晶。

一個AOTF的有效線性孔徑由一維聲束的高度和由在其他維度橫跨光學孔徑的聲衰減（在聲波傳播的距離）的限制。在AOTF晶體內(nèi)所產(chǎn)生的聲束的高度由性能和聲學換能器的物理特性決定的。在晶體材料如二氧化碲聲衰減正比于聲頻率的平方，并且因此是一個比較麻煩的限制線性孔徑大小在更短的波長的可見光范圍內(nèi)，這就需要更高的RF頻率進行調(diào)諧。近紅外和紅外輻射產(chǎn)生的，因為與這些較長波長的衍射相關聯(lián)的較低的聲頻率的限制較少的限制。 

單個聲換能器的最大尺寸是由性能和功率要求除了儀器配置的幾何限制的約束，并AOTF設計人員可使用換能器結(jié)合到晶體的陣列，以增加傳播的有效橫向尺寸聲束，并以放大的聲光相互作用的區(qū)域。所需要的驅(qū)動功率是在聲光設計中最重要的變量之一，并且通常與光學孔徑和更長的波長而增加。相反，聲衰減，這是減少在紅外光譜范圍內(nèi)，以驅(qū)動換能器的紅外線AOTFs需要更高的功率是在這些設備的最大限制之一。高的驅(qū)動功率電平導致的晶體，這可能會導致熱漂移和不穩(wěn)定的濾波器性能的加熱。這是特別的一個問題時，聲功率和頻率而變化迅速，大范圍的，和晶體溫度沒有足夠的時間來穩(wěn)定，產(chǎn)生的折射率瞬態(tài)變化。如果應用程序需要的波長和強度的穩(wěn)定性和可重復性，在AOTF中應保持在一個恒定的溫度。采取由設備制造商，以盡量減少此問題的一種方法是將加熱超過環(huán)境溫度的晶體，到一定程度，它是相對地不受由換能器的驅(qū)動功率的附加的熱輸入。另一種解決方案是，房子在一個熱電的AOTF冷卻外殼，可提供精確的溫度調(diào)節(jié)。持續(xù)發(fā)展努力承諾導致新的材料，可以提供相對較大的孔相結(jié)合的過濾和未過濾束的有效分離，不使用偏振器，而需要的典型裝置的驅(qū)動功率的一小部分。

在非共線的AOTF，其在空間上分離的入射光和衍射光的路徑時，偏轉(zhuǎn)角（對角分離衍射和非衍射光束離開晶體）是一個額外的因素限制了裝置的有效孔徑。如先前所討論的，偏轉(zhuǎn)角為大于對于具有更大的雙折射晶體，并且確定部分所需的衍射和非衍射光束的足夠的分離的傳播距離離開晶體后發(fā)生。所需的距離增大為較大的入口孔，和該規(guī)定，因為對組件的物理尺寸可以被并入到顯微鏡系統(tǒng)約束對最大孔徑大小有實際限制。的孔徑角是關系到AOTF中，在成像系統(tǒng)中的一個重要因素的總集光功率，雖然為了實現(xiàn)全孔徑角而不在非共線的AOTF使用偏光板，其值必須是比偏轉(zhuǎn)角小。 

因為聲光可調(diào)諧濾波器是不顯微鏡系統(tǒng)的圖象形成部件（因為它通常被用于源過濾），有評價的空間分辨率為這種類型的設備的任何特定方法。但是，聲光可調(diào)濾波器可以限制由于其有限的線性孔徑大小和接受角的成像系統(tǒng)的可達到的空間分辨率，以相同的方式與其他的光學部件。根據(jù)瑞利準則和AOTF的角位移和線孔，可分辨的圖像元素的最大數(shù)量可以被計算為一個給定的波長，使用了極性和方位角的平面不同的表達式。盡管衍射極限的分辨率可以得到在方位角平面上，分散在AOTF限制在極性面的分辨率，并且必須采取措施來抑制這種因子，以獲得最佳的性能。上波長的偏轉(zhuǎn)角的依賴性可以產(chǎn)生一種形式的分散體中，當在一個相對窄的帶寬進行調(diào)整，但在涉及操作在寬的光譜范圍內(nèi)的應用程序顯著通常是可以忽略的。變化與波長的偏轉(zhuǎn)角可以在調(diào)節(jié)過程中產(chǎn)生的圖像的變化，在諸如激發(fā)的不同波長的熒光的比值的成像技術(shù)產(chǎn)生的錯誤，并且在其他多光譜的應用程序。時的圖像偏移服從一個已知的關系，以波長，校正可通過數(shù)字處理技術(shù)被應用。分散體的其他作用，包括降低的角分辨率，可能會導致圖像質(zhì)量下降，如模糊，這需要更復雜的措施來抑制。

在共聚焦顯微鏡AOTF優(yōu)勢總結(jié)

綜合考慮，涉及到AOTFs在成像系統(tǒng)中的應用程序的操作和性能因素的基本原則，許多這類設備的光控熒光共聚焦顯微鏡的優(yōu)點是顯而易見的。 AOTF中的幾個好處結(jié)合起來，極大地提高了最新一代的激光共聚焦儀器的多功能性，而這些設備正在成為流行的激發(fā)波長范圍和強度的控制越來越多。促進所述的AOTF的幾乎每一個優(yōu)點主要特性是它的能力，以允許在逐個象素的基礎上的強度和/或照明波長的顯微鏡控制，同時保持高的掃描速率。這個單一特征轉(zhuǎn)化成各種各樣的有用的分析顯微鏡工具，其進一步在靈活性增強當激光照射時使用。 

其中最有用的AOTF功能允許的小用戶定義的試樣的區(qū)域（感興趣的通常被稱為區(qū)域; ROI）的選擇，可與任一較大或較小強度被照亮，并在不同的波長，用于精確控制在漂白工藝，激發(fā)率研究，共振能量轉(zhuǎn)移的調(diào)查，或光譜測量（參見圖5）。照明強度，不僅可以在選定的區(qū)域可以增加控制的光漂白實驗，但可以衰減在所希望的區(qū)域，以減少不必要的光漂白。當該照明區(qū)域是根據(jù)AOTF控制，激光曝光被限制為默認的掃描區(qū)域，以及該裝置的非?？焖俚捻憫梢员挥脕頇z流計掃描鏡周期的回掃間隔期間提供光束消隱，從而進一步限制了不必要的標本暴露。在實踐中，激發(fā)地區(qū)按徒手畫或使用工具制作所定義的幾何形狀，在電腦顯示器上的圖像覆蓋面通常定義。一些系統(tǒng)允許激光照射來定義任意數(shù)目的樣本區(qū)，激光強度被設置為不同的電平的每個區(qū)域中，在強度增量小到了0.1％。當AOTF是結(jié)合多個激光器和軟件，允許連續(xù)觀測的時間過程控制，時間推移實驗可設計成獲得在單次實驗中，這可能，例如，被定義為對應于不同的從幾個不同的區(qū)域的數(shù)據(jù)細胞器。 

圖5示出了興趣（投資回報），在激光掃描共聚焦顯微鏡先進的熒光應用中創(chuàng)建用戶定義的區(qū)域的幾個例子。在每個圖像中，投資回報率都列出了一個黃色的邊框。在圖5中給出的鼠袋鼠細胞（PTK2線）（a）的矩形區(qū)域中已被指定為光漂白實驗細胞質(zhì)的中央部。駐留在這個區(qū)域的熒光團可通過高功率激光強度被選擇性破壞，熒光的后續(xù)恢復監(jiān)視測定擴散系數(shù)。幾個徒手的ROI被顯示在圖5（b）所示，其可以是目標對選定的照度或光漂白實驗。 （;麂細胞與黃色熒光蛋白圖5（c））在共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），熒光發(fā)射率可以通過在共聚焦顯微鏡的選定區(qū)域通過觀察漂白在這些方面的受體熒光的效果容易地確定。激光激發(fā)的在選定區(qū)域具有共焦顯微鏡的AOTF控制也是蛋白質(zhì)擴散的使用熒光蛋白在光活化的研究調(diào)查是有用的，如圖5（d）所示。此圖像幀呈現(xiàn)在楓蛋白的熒光發(fā)射峰，因為它從綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的HeLa使用所選照明（黃色方塊）與405納米的藍紫色激光二極管（人宮頸癌）細胞。

AOTF的快速強度和波長切換功能可在每個激發(fā)波長可以以平衡各信號電平，以獲得最佳的成像被分配一個不同強度的多個激光線將被執(zhí)行的順序線掃描。從各熒光團同時減少交叉，可以是具有同步多波長勵磁用顯著問題個別的行順序掃描減少信號采集之間的時間差（參見圖6）。多個熒光探針的同步摻入活細胞已經(jīng)發(fā)展成為一個非常有價值的技術(shù)的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用的研究中，與高分子復合組件的動態(tài)特性。的技術(shù)將綠色熒光蛋白（GFP）及其眾多衍生物進入細胞的蛋白合成機制的細化已經(jīng)徹底改變了活細胞的實驗。用活組織多個探頭研究的一個主要挑戰(zhàn)是必須要獲得完整的多光譜數(shù)據(jù)集的速度不夠快，以減少樣本的運動和分子的變化，可能扭曲真實的試樣幾何形狀或事件的動態(tài)序列。在AOTF中提供的速度和多功能性，以控制波長和強度照射多個樣品的區(qū)域，并同時或依次掃描各以足夠的速度準確地監(jiān)測動態(tài)細胞過程。 

AOTFs和中性密度濾鏡的應用程序來控制激光共聚焦顯微鏡的熒光光譜分離的比較示于圖6。標本是貼壁赤麂鹿沾上的Alexa Fluor皮膚成纖維細胞568結(jié)合到鬼筆環(huán)肽單層培養(yǎng)（目標絲狀肌動蛋白網(wǎng)絡）和SYTOX綠色（染色在細胞核中的DNA）。產(chǎn)生的高激勵信號所必需的兩種熒光團中性密度濾光片導致顯著量泄流通過SYTOX綠發(fā)射的進入的Alexa Fluor568信道（圖6的（a），記下黃核）。 SYTOX綠和Alexa Fluor568之間的共定位的高度在圖6中清楚地示出的散點圖（b）所示。在散點圖兩軸代表SYTOX綠色（橫坐標）和的Alexa Fluor568（縱坐標）的渠道。為了平衡所必需的激發(fā)功率水平來選擇性地照射每個熒光團具有更大的控制發(fā)光強度的，一個AOTF被用于選擇性降低SYTOX綠激發(fā)功率（氬離子激光線在488納米）。注意，在隨后的減少滲出，通過如在圖6（c）該細胞的細胞核表現(xiàn)為綠色。相應的散點圖（圖6（D））表示滲出通過SYTOX綠色的顯著水平降低到的Alexa Fluor568路。 

AOTF的發(fā)展光漂白（FRAP），熒光損失在光漂白（FLIP），以及在局部光活化熒光（解籠鎖）的研究（參見圖5）后，提供了大量的附加的通用性，如熒光恢復技術(shù)。該FRAP技術(shù)的初衷是測量熒光標記蛋白質(zhì)的細胞器和細胞膜擴散速率。在以往的FRAP過程，在試樣上的一小點被連續(xù)地照射在低光束的水平和所發(fā)射的熒光進行測定。的照度水平，然后上升到非常高的水平很短的時間通過快速漂白破壞在被照射的區(qū)域中的熒光分子。后的光強度，返回到原來的低電平時，熒光被監(jiān)測，以確定在哪些新的漂白的熒光分子擴散到耗盡區(qū)的速率。的技術(shù)中，作為一般使用，已經(jīng)由漂白的區(qū)域，這往往是受衍射限制光斑的固定幾何形狀的限制，并且由具有以機械方式調(diào)節(jié)的照明強度（使用擋板或檢流計驅(qū)動的組件）。在AOTF中，不僅允許的光強度接近瞬時切換，但也可以用于選擇性地漂白的不規(guī)則形狀，線，或特定的細胞器，隨機指定的區(qū)域，并確定分子轉(zhuǎn)移到該區(qū)域的動態(tài)。 

通過使照明光束的幾何形狀和波長和強度的快速切換的精確控制，在AOTF是顯著增強應用的倒裝技術(shù)在測定某些細胞蛋白質(zhì)的擴散遷移率。這種技術(shù)監(jiān)測的熒光從連續(xù)點亮局部區(qū)域的損失和熒光團從遙遠的地方到枯竭的網(wǎng)站再分配。獲得的數(shù)據(jù)可在細胞內(nèi)和細胞間部件之間的動態(tài)相互關系的確定有助于活組織，并且這種熒光損失研究是由AOTF的控制的顯微鏡照明的能力極大地方便了。 

利用光活化的熒光的方法已在研究中非常有用，例如那些研究中的細胞過程的鈣離子濃度的作用，但在它的靈敏度一直局限于在小細胞器或靠近細胞膜局部區(qū)域的效果。通常，通過被結(jié)合到光敏物質(zhì)失活的熒光物質(zhì)（稱為被籠）是由從隔離罩化合物釋放它們，并允許他們通過熒光突然出現(xiàn)的被跟蹤強光照射激活。利用聲光可調(diào)濾波器的推動了這種研究，以評估高度本地化的過程，如鈣離子動員膜附近，因為做照明觸發(fā)感興趣的熒光分子的活化（解籠鎖）的精確快速控制可能的改進。 

由于AOTF中的功能，在不使用移動的機械部件的，以電子方式控制的波長和多個激光器的強度，大的通用性被設置為外部控制和帶的顯微鏡實驗等方面的激光照射的同步。當共聚焦儀器配有一個控制器模塊具有輸入和輸出觸發(fā)端子，激光強度水平可以連續(xù)地監(jiān)測和記錄，并且所有的激光功能的操作可以被控制與其他試驗樣品的測量，自動化顯微鏡載物臺的運動，以協(xié)調(diào)，連續(xù)的慢速錄制，以及任何數(shù)量的其他操作。