奧林巴斯顯微鏡雅布倫斯基的能量圖
熒光染料對(duì)能量的吸收發(fā)生之間密切間隔的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的激發(fā)態(tài)中不同的分子軌道。不同能量水平參與的吸收和發(fā)射光的熒光經(jīng)典介紹由雅布倫斯基能量圖，波蘭物理學(xué)家亞歷山大 · 雅布倫斯基教授的名字命名。本教程將探討如何共同熒光團(tuán)中的電子被激發(fā)從地面狀態(tài)到更高的電子能量狀態(tài)，和發(fā)生的事件，當(dāng)這些激發(fā)的分子放松的時(shí)候由光子發(fā)射和其他機(jī)制對(duì)*終跌落到地面的能量狀態(tài)。
一個(gè)典型的雅布倫斯基圖說(shuō)明了基態(tài) （套裝 (0)），以及*次 （S(1)） 和第二 (S(2)) 激發(fā)的單線(xiàn)國(guó)家作為堆棧的水平線(xiàn)。在本教程中，較粗的線(xiàn)條表示電子的能量水平，而薄的線(xiàn)表示 （忽略轉(zhuǎn)動(dòng)能量狀態(tài)） 的各種振動(dòng)能量狀態(tài)。作為直或呈波浪狀箭頭，取決于是否過(guò)渡與吸收或發(fā)射一個(gè)光子 （直箭頭） 相關(guān)聯(lián)，或從分子內(nèi)部轉(zhuǎn)換或非輻射弛豫過(guò)程 （波浪箭頭） 結(jié)果說(shuō)明狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。利用垂直向上箭頭的指示激發(fā)過(guò)程的瞬時(shí)性質(zhì)而波浪箭頭留給更長(zhǎng)的時(shí)間尺度發(fā)生的那些事件。
與經(jīng)典的雅布倫斯基教程初始化圖出現(xiàn)在窗口，其中顯示地面狀態(tài) （套裝 (0)），以及*次 （S(1)） 和第二 (S(2)) 激發(fā)的單線(xiàn)態(tài)。位于右側(cè)的單線(xiàn)態(tài)狀態(tài)的振動(dòng)能級(jí)的激發(fā)三重態(tài) （T(1)） 狀態(tài)。運(yùn)行本教程中，單擊啟動(dòng)按鈕啟動(dòng)一連串的勵(lì)磁和放松事件由下拉式菜單 （熒光發(fā)射是默認(rèn)值） 中列出的過(guò)程。一旦電子到達(dá)激發(fā)的態(tài)振動(dòng)能級(jí)，它會(huì)慢慢地放松到*激發(fā)態(tài)的*低振動(dòng)能級(jí)。從這個(gè)層面電子將根據(jù)所選進(jìn)程的行為。電子躍遷的近似生存期教程窗口中顯示的每個(gè)過(guò)渡發(fā)生時(shí)。
光的吸收非常迅速地發(fā)生 （大約一飛，需要足夠的時(shí)間，為旅行單一波長(zhǎng)的光子) 在離散量稱(chēng)為廣達(dá)和對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)從地面狀態(tài)到興奮的狀態(tài)。同樣，一個(gè)光子通過(guò)熒光或磷光的排放也被衡量量程。在量子 （普朗克定律） 的能量是方程表示的：
其中E是能量， h是普朗克常數(shù)， ν和λ是頻率和波長(zhǎng)的傳入的光子的和c是光的速度。普朗克定律支配被吸收的光子的輻射能量是直接成正比的頻率和波長(zhǎng)成反比意味著更短的入射波長(zhǎng)具有更大的量子的能量。吸收到的光子的能量由熒光基團(tuán)，發(fā)生相互作用的光波的振蕩電場(chǎng)矢量與分子中的電荷 （電子），是一種全部或沒(méi)有的現(xiàn)象，出現(xiàn)的只有可以稱(chēng)為吸收帶的特定波長(zhǎng)的入射光。如果被吸收的光子包含更多的能量，不是一個(gè)簡(jiǎn)單的電子遷移的必要條件，多余的能量是通常轉(zhuǎn)換成振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)的能量。然而，如果一種分子和有沒(méi)有足夠的能量來(lái)推動(dòng)轉(zhuǎn)型光子之間發(fā)生碰撞，沒(méi)有吸收會(huì)發(fā)生。光譜廣泛吸收帶出現(xiàn)從加間隔緊密的振動(dòng)能級(jí)上使光子能量，以匹配特定轉(zhuǎn)換范圍的熱運(yùn)動(dòng)。因?yàn)榧ぐl(fā)的一種分子的吸收通常沒(méi)有電子自旋配對(duì)的改變發(fā)生時(shí)，激發(fā)的態(tài)也是單線(xiàn)態(tài)。一般情況下，熒光的調(diào)查具有波長(zhǎng)從紫外到電磁波譜 （250 到 700 納米） 的可見(jiàn)區(qū)域的輻射。
用紫外或可見(jiàn)的光，常見(jiàn)的熒光團(tuán)通常激發(fā)到較高振動(dòng)能級(jí) (S(1)) *或第二 (S(2)) 單重態(tài)能量狀態(tài)。到第二激發(fā)態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)從*低的振動(dòng)能級(jí)的基態(tài)的發(fā)生提出了圖 1 （左側(cè)綠色箭頭） 的吸收 （或勵(lì)磁） 轉(zhuǎn)換之一 （轉(zhuǎn)型記為套裝 (0) = 0 到S(2) = 3）。第二次勵(lì)磁過(guò)渡從第二次的振動(dòng)能級(jí)基態(tài)的刻畫(huà)*高振動(dòng)能級(jí)中的*激發(fā)態(tài) （記為套裝 (0) = 1 到S(1) = 5）。在典型的熒光基團(tuán)，照射較大范圍的波長(zhǎng)將生成整個(gè)范圍的允許填充各種振動(dòng)能級(jí)的激發(fā)態(tài)的躍遷。一些這些轉(zhuǎn)換將的概率比其他人更高的學(xué)位和組合時(shí)，將會(huì)構(gòu)成分子的吸收譜。請(qǐng)注意對(duì)于大多數(shù)熒光團(tuán)，吸收和激發(fā)光譜是不同的但往往重疊可以有時(shí)幾可亂真。在其他情況下 (熒光素) 清楚地分隔的吸收和激發(fā)光譜。
緊接著吸收一個(gè)光子，幾個(gè)進(jìn)程會(huì)發(fā)生同不同的概率，但*有可能將是*激發(fā)態(tài)的*低振動(dòng)能級(jí)弛豫 (S(1)= 0 ；圖 1）。這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為內(nèi)部轉(zhuǎn)換或振動(dòng)弛豫(在沒(méi)有光的發(fā)射能量損失)，通常會(huì)發(fā)生在皮秒或更少。因?yàn)榇罅康恼駝?dòng)周期發(fā)生在激發(fā)態(tài)的生存期內(nèi)，分子幾乎總是接受完整的振動(dòng)弛豫，在他們激動(dòng)的一生期間。多余的振動(dòng)能量轉(zhuǎn)化為熱量，鄰近溶劑分子與激發(fā)的態(tài)熒光基團(tuán)發(fā)生碰撞后被吸收。
一種興奮的分子存在于*低激發(fā)的態(tài) （S(1)） 為納秒 （熒光過(guò)程由幾個(gè)數(shù)量級(jí)的時(shí)間*長(zhǎng)的時(shí)間段） 前*后放寬至基態(tài)的周期。如果從這長(zhǎng)壽命狀態(tài)松弛伴隨一個(gè)光子發(fā)射，過(guò)程被正式稱(chēng)為熒光。間隔緊密的振動(dòng)能級(jí)的基態(tài)，當(dāng)正常的熱運(yùn)動(dòng)，再加上在發(fā)射過(guò)程中產(chǎn)生了廣泛的光子能量。其結(jié)果是，熒光是通常觀察到排放強(qiáng)度作為一個(gè)樂(lè)隊(duì)的波長(zhǎng)，而不是一條鋒利的線(xiàn)。大多數(shù)的熒光團(tuán)可以重復(fù)的激發(fā)和發(fā)射周期很多幾百到幾千次才高活性激發(fā)的態(tài)分子是光漂白，導(dǎo)致破壞的熒光。例如，充分研究的探針熒光素異硫氰酸酯 （FITC） 可以進(jìn)行勵(lì)磁、 前分子不再響應(yīng)入射光照到大約 3 萬(wàn)次的放松。
其它幾個(gè)有不同程度的概率的松弛通路的熒光發(fā)射過(guò)程與競(jìng)爭(zhēng)。激發(fā)的態(tài)能量可以非-輻射熱 （由圖 1 中的青色波浪箭頭所示） 作為消退、 熒光激發(fā)可以與另一個(gè)分子傳遞能量的非輻射過(guò)程 （例如，淬滅，如圖 1 中的紫色波浪箭頭所示），第二個(gè)類(lèi)型中碰撞或稱(chēng)為系統(tǒng)間穿越到*低激發(fā)的態(tài)的現(xiàn)象可以發(fā)生 （圖 1 中的藍(lán)色波浪箭頭）。后者的事件相對(duì)較少，但*終結(jié)果無(wú)論是在發(fā)射的光子通過(guò)磷光或轉(zhuǎn)回收益率延遲熒光激發(fā)的單線(xiàn)態(tài)。轉(zhuǎn)換從三重態(tài)到基態(tài)的激發(fā)的態(tài)都是禁止的這導(dǎo)致速率常數(shù)中的三重態(tài)排放都比那些為熒光低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
兩者的三重態(tài)狀態(tài)轉(zhuǎn)換圖解上右手邊的圖 1 所示的雅布倫斯基能源配置文件。系統(tǒng)互通過(guò)境的可能性很低而引起的分子必須首先接受自旋轉(zhuǎn)換來(lái)產(chǎn)生未成對(duì)的電子，不利的過(guò)程。三重態(tài)的基本重要性是化學(xué)反應(yīng)中這種狀態(tài)，其結(jié)果往往在光漂白和生產(chǎn)的有害的自由基的分子所表現(xiàn)出的高度。生物標(biāo)本中溶解的氧是非常有效的三重態(tài)的熒光猝滅劑。基態(tài)氧分子，這通常是一個(gè)三重態(tài)，可以激發(fā)到無(wú)功單線(xiàn)態(tài)，導(dǎo)致反應(yīng)，漂白熒光基團(tuán)或表現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的光毒性效應(yīng)。熒光團(tuán)在三重態(tài)也可以直接與其他的生物分子，經(jīng)常造成失能的這兩個(gè)物種反應(yīng)。分子中含有重原子，鹵素和許多過(guò)渡金屬等經(jīng)常方便系統(tǒng)互通過(guò)境，頻繁地磷光。
它是有趣地注意到的熒光發(fā)射譜通常是套裝 (0) S(1)吸收譜過(guò)渡到一個(gè)鏡像。這是，電子激發(fā)并不能改變?cè)雍说膸缀涡螤詈图ぐl(fā)的態(tài)振動(dòng)能級(jí)的間距是相似的基態(tài)。*終的結(jié)果是熒光發(fā)射光譜記錄分光光度法測(cè)定常顯示類(lèi)似，但逆轉(zhuǎn)，振動(dòng)結(jié)構(gòu)對(duì)那些在吸收譜中觀察到。