徠卡顯微鏡惠更斯STED反卷積快速指南
本文檔的目的是給徠卡STED用戶簡(jiǎn)要介紹了使用與Leica TCS STED SP8 3倍顯微鏡獲得的圖像惠更斯專業(yè)解卷積圖像。
圖1（從左至右）：共焦; 受激發(fā)射損耗; 受激發(fā)射損耗反褶積
參數(shù)編輯器（在圖像的縮略圖右鍵點(diǎn)擊）
圖2：概述惠更斯圖像參數(shù)編輯器。 這個(gè)窗口可以訪問所需的受激發(fā)射損耗解卷積圖像的所有相關(guān)圖像參數(shù)。 導(dǎo)入時(shí)，LIF文件，大部分參數(shù)都自動(dòng)從元數(shù)據(jù)提取（見惠更斯Pro用戶指南從SVI更多信息）。
采樣間隔（XYZT）：從圖片屬性獲得的值
顯微鏡類型：值從圖片屬性取
數(shù)值孔徑：數(shù)值從圖片屬性取
客觀質(zhì)量：取默認(rèn)值“好”
蓋玻片位置：使用專用工具（圖示左側(cè)）
拍攝方向：對(duì)于DMI顯微鏡總是“向上”
針孔間距：不相干的共焦/ STED顯微鏡
鏡片浸泡：用“油”
包埋劑：從下拉菜單中選擇合適的媒介。
Backproj。 從圖片屬性獲得的值： 針孔
激發(fā)波長(zhǎng)值從圖片屬性取
發(fā)光波長(zhǎng)值從圖片屬性取
多光子激發(fā)：值從圖片屬性取
激發(fā)填充因子：從圖片屬性獲得的值; 默認(rèn)值= 2，除了TiSaph受激發(fā)射損耗（值= 1.2）
受激發(fā)射損耗耗盡型：從圖片屬性獲得的值
STED飽和系數(shù)：見下面的更多細(xì)節(jié)
受激發(fā)射損耗波長(zhǎng)值從圖片屬性取
受激發(fā)射損耗免疫力分?jǐn)?shù)：見下面的更多細(xì)節(jié)
受激發(fā)射損耗3X：請(qǐng)參閱下面的詳細(xì)資料
受激發(fā)射損耗飽和度的因素
飽和因素原本是指期限：
這是受激發(fā)射損耗分辨率公式的一部分：
它定義了STED PSF的全寬半高（FWHM），最后STED圖像的分辨率。 與門控受激發(fā)射損耗和TCS STED SP8 3X，經(jīng)典的理解飽和因子（主要依賴于激光強(qiáng)度和所選擇的染料的消耗效率）的實(shí)施是由包括關(guān)于激勵(lì)和損耗激光模式（附加信息擴(kuò)展脈沖或CW）和門控檢測(cè)。 在實(shí)踐中，有兩個(gè)參數(shù)影響STED的分辨率，因此惠更斯飽和系數(shù)：STED耗盡激光強(qiáng)度和柵極起始數(shù)值。 請(qǐng)記住，為了簡(jiǎn)化和整體實(shí)用性，被用于受激發(fā)射損耗PSF在惠更斯的計(jì)算只有一個(gè)“理想”染料的I SAT值。 每默認(rèn)情況下，3.3和LAS AF版本后，預(yù)測(cè)值（來自成像參數(shù)）會(huì)自動(dòng)在圖像屬性中設(shè)置并轉(zhuǎn)移到惠更斯。 對(duì)。LIF的是在LAS AF的早期版本中獲得的文件，飽和度的因素需要在惠更斯手動(dòng)輸入。 飽和系數(shù)的值可能需要取決于染料的受激發(fā)射損耗效率進(jìn)一步調(diào)整。 保持眼睛上的圖像分辨率（線剖面測(cè)量）的情況下，需要一些額外的改變。 下面，將顯示一個(gè)陣列示出了飽和度因子與幾種計(jì)算出的PSF的FWHM值之間的關(guān)系。 它應(yīng)該提供的情況下的基準(zhǔn)的實(shí)際圖像分辨率不同于預(yù)測(cè)1。
圖3：一個(gè)數(shù)列計(jì)算的PSF匯編（操作窗口 - >理論P(yáng)SF）具有不同的飽和度因子（SF）呈現(xiàn)增加（但不是線性的！）全寬半高（FWHM）值。 像素尺寸：15納米。
飽和因子值和現(xiàn)實(shí)之間顯著的差異可以在反褶積的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：
飽和系數(shù)太高：計(jì)算PSF是比真實(shí)的PSF顯著較小。 這將導(dǎo)致在工件視為不與原始圖像相關(guān)聯(lián)強(qiáng)烈粒狀結(jié)構(gòu)。 此外，噪聲可以被誤解為信號(hào)（箭頭，見下文）。 在一般情況下，過小的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的預(yù)測(cè)將會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)不太明顯的影響，但小斑點(diǎn)和紋理可被誤判為結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和結(jié)果在成像數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤解釋。
圖4：對(duì)圖像質(zhì)量設(shè)置過高的飽和度的因素。 箭頭表示可能的工件（噪聲放大和過度造粒和結(jié)構(gòu)的反差）。
飽和因數(shù)過低：圖片會(huì)出現(xiàn)令人費(fèi)解的，幾乎不管信噪比選擇在STED反卷積向?qū)Вㄒ娤挛模?/span> 降噪可能仍然是可以接受的，但去卷積圖像將獲得更多的信息與可能的工件生成一個(gè)巨大的損失（箭頭，見下文）。
圖5：對(duì)圖像質(zhì)量設(shè)置得太低飽和度的因素。 箭頭表示顯示哪些可以在原始數(shù)據(jù)清楚地識(shí)別顯子結(jié)構(gòu)的喪失斑點(diǎn)。
受激發(fā)射損耗3X
惠更斯居然直接從。LIF文件的圖片屬性提取正確的值。 不過也有一些事情要考慮。 在主要的受激發(fā)射損耗3D滑塊調(diào)節(jié)光的進(jìn)入既可以通過“旋渦”，或“3D甜甜圈”光束的路徑，這將對(duì)橫向和軸向分辨率的增加之間的比率產(chǎn)生影響的百分比。
因此，計(jì)算出的PSF具有相同飽和度的形狀根據(jù)三維滾動(dòng)條的位置而變化。 橫向分辨率不斷減小，而軸向分辨率的增加（見例計(jì)算的PSF與在圖6 30飽和值）。
分辨率增加，無論是尺寸，最后在其各向同性分辨率達(dá)到了3D滑塊百分比之間的比率又是依賴于所選擇的染料的受激發(fā)射損耗效率。
圖6：在惠更斯編譯生成不同的PSF計(jì)算的（操作窗口 - >理論P(yáng)SF）隨著3D STED值， 隨著光的兩條光路之間的再分配的軸向和橫向半高寬之比顯著變化。 像素尺寸：15納米×40納米（XY）。
確定在3D STED正確的飽和系數(shù)的最簡(jiǎn)單的方法在于獲得一個(gè)額外的控制圖像和0％STED 3D和調(diào)整惠更斯飽和因素對(duì)測(cè)量FWHM。 相同的飽和度因子然后可以只要同一STED激光強(qiáng)度和柵極啟動(dòng)值被使用用于所有三維STED滑塊的位置。
受激發(fā)射損耗免疫力分?jǐn)?shù)
“免疫分?jǐn)?shù)”的惠更斯定義是由熒光基團(tuán)，它們是免疫的受激發(fā)射損耗消耗的激光，并且可以被描述為被添加到純STED PSF一個(gè)附加的共焦聚砜組分的人口給出。
圖7： 兩個(gè)受激發(fā)射損耗的PSF比較。 在左邊的“純”受激發(fā)射損耗PSF可以看出，與設(shè)置為0％的免疫力分?jǐn)?shù)。 在右邊用15％的免疫餾分產(chǎn)生的相同的PSF。 像素尺寸為15納米。
這里，免疫分?jǐn)?shù)是一個(gè)寬泛的定義，旨在覆蓋三個(gè)不同的受激發(fā)射損耗的影響：
反斯托克斯激勵(lì)與受激發(fā)射損耗損耗激光：
在某些情況下，受激發(fā)射損耗耗盡激光也可以激發(fā)染料。 這始終是依賴于染料/激光組合。 徠卡的推薦染料/激光組合通常有沒有只非常少的反斯托克斯激勵(lì)，但在某些情況下（多色實(shí)驗(yàn)），可能有必要使用染料在光譜上位于更靠近STED耗盡激光。 對(duì)于去卷積的PSF足跡的額外的增加可以通過增加免疫分?jǐn)?shù)來模擬。 注意，受激發(fā)射損耗消耗激光器具有不同PSF的形狀（面包圈），以有一個(gè)固定的激發(fā)激光（點(diǎn)），這是沒有考慮到在免疫分?jǐn)?shù)的計(jì)算。短壽命成分在STED CW和門控STED：
CW受激發(fā)射損耗損耗增加熒光壽命到受激發(fā)射損耗PSF，這偏見分辨率朝發(fā)射較長(zhǎng)的壽命一個(gè)顯著的貢獻(xiàn)。 短暫的熒光，而另一方面，有受激發(fā)射損耗低效率和較差的分辨率。 熒光信號(hào)總是由不同生命周期的組件，所有在最后的STED CW PSF加起來的整個(gè)范圍。 因此，短壽命熒光是“免疫”的受激發(fā)射損耗光，這會(huì)導(dǎo)致類似的PSF對(duì)那些出現(xiàn)在圖7B中。 在檢測(cè)該底座將是不太突出的多門使用。 作為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，STED CW使用高達(dá)10％的免疫分?jǐn)?shù)，而門控STED圖像是在3％至5％的范圍內(nèi)。可憐的損耗效率脈沖受激發(fā)射損耗：
在大多數(shù)情況下，脈沖受激發(fā)射損耗的解決方案為您提供了STED PSF的清潔形式。 然而，由于同步問題，本征染料光物理學(xué)和寬度STED激光脈沖，染料的人口可能不被有效地耗盡，并且每個(gè)定義免疫耗竭激光。
總體而言，免疫餾分具有只在去卷積的圖像的質(zhì)量幾乎沒有影響。 在情況下，真正的受激發(fā)射損耗PSF底座是相當(dāng)廣泛的（強(qiáng)反斯托克斯激發(fā)和STED CW）調(diào)整計(jì)算PSF的免疫力分?jǐn)?shù)到適當(dāng)?shù)乃娇赡苁馆^低的背景閾值水平。 另一方面較低的背景估計(jì)的增加的信息可以提取/從原始圖像增強(qiáng)的量。
在理論P(yáng)SF免疫力分?jǐn)?shù)非常低的水平會(huì)使該算法忽略了真實(shí)的PSF，這可以通過軟件作為一個(gè)真正的信號(hào)最終被誤判的基座，并會(huì)最終導(dǎo)致文物，像小邊強(qiáng)的信號(hào)放大結(jié)構(gòu)圖像。
結(jié)論
匹配計(jì)算，理論P(yáng)SF，以“真正的”一罐需要幾分鐘的嘗試。 但是，一旦確定，有類似的設(shè)置實(shí)驗(yàn)之間的差異在PSF形狀是微乎其微的。 此外，隨著越來越多的經(jīng)驗(yàn)，這些調(diào)整變得隨著時(shí)間的推移更加容易。
有在惠更斯的工具，可以幫助點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的FWHM值，這是在反褶積有幫助的估計(jì)。 在“FWHM PSF估計(jì) ”所在的“ 分析 ”一 節(jié)中給定的圖像與單一的PSF可見的自動(dòng)生成的FWHM估計(jì)。 這可以用來猜測(cè)為顯微鏡的任一對(duì)非常小的熒光珠（<35納米）或者甚至在小的結(jié)構(gòu)，或者在實(shí)際樣品內(nèi)的熒光背景的分辨率的近似值。 這些值可以被用來調(diào)整所計(jì)算PSF的圖像參數(shù)。
一個(gè)更優(yōu)雅，也更先進(jìn)的解決方案是由“PSF蒸餾器向?qū)А?/em>的“反褶積”一節(jié)中找到提供。 此處的實(shí)際的PSF被測(cè)量并轉(zhuǎn)換成一個(gè)數(shù)學(xué)模型。 用蒸餾水PSF解卷積的數(shù)據(jù)最終會(huì)得到最好的結(jié)果，因?yàn)樗紤]到了系統(tǒng)特定的缺陷和不對(duì)稱。 滌綸短纖蒸餾器需要具有非常好的信號(hào) - 噪聲水平的圖像正確地提取所需的信息。
解卷積精靈（圖片縮略圖右鍵點(diǎn)擊）
所有圖片屬性現(xiàn)在可以正確地設(shè)置，接下來的步驟包括使用反卷積向?qū)У淖詈蟮膱D像處理。 在此步驟中，用戶是通過一系列的步驟，這將定義卷積參數(shù)并最終執(zhí)行反卷積引導(dǎo)。 的SVI（網(wǎng)站上的部分-的去卷積步驟和圖像處理工具，在惠更斯軟件的完整描述可以的“>手冊(cè)下載”中的“ 專業(yè)用戶指南”中找到www.svi.nl ）。 在這個(gè)快速指南只有最相關(guān)的步驟將包括生成高質(zhì)量的圖像和避免最常見的器物。
選擇一個(gè)PSF /負(fù)載卷積模板
圖8：加載卷積模板和文件的特殊專業(yè)服務(wù)公司。
在這個(gè)步驟中，用戶被要求加載之前保存的卷積模板并導(dǎo)入先前計(jì)算，或蒸餾水PSF表示。 如果沒有值或引用本節(jié)被加載后，軟件會(huì)使用去卷積的圖像作為參考圖像參數(shù)（參見參數(shù)編輯器以上）自動(dòng)生成計(jì)算PSF。 請(qǐng)注意，反褶積精靈還提供了擴(kuò)展的幫助文件（參見圖8，9，10和12的黃色文本框），并直接鏈接到SVI網(wǎng)頁。 為了快速卷積實(shí)驗(yàn)，這一步可以忽略不計(jì)。
裁剪工具
圖9：裁剪圖像，以減少數(shù)據(jù)量，提高卷積速度。
在這第二步驟中，用戶被給予機(jī)會(huì)來移除圖像的空的區(qū)域，以提供更有效和更快的去卷積處理。 “自動(dòng)裁剪”選項(xiàng)將自動(dòng)生成建議裁剪邊界，這進(jìn)一步增加了易用性。
直方圖工具和背景估計(jì)
圖10：剪切明亮的信號(hào)和背景估計(jì)是反褶積至關(guān)重要的參數(shù)。
檢查圖像的直方圖和定義背景水平是至關(guān)重要的結(jié)果的質(zhì)量。 在直方圖檢查軟件警告說，非常明亮的圖像包含的區(qū)域，其中像素的強(qiáng)度達(dá)到最大值（在8位圖像，255）的用戶。 在這些“飽和”的區(qū)域由強(qiáng)度分布圖中給出的結(jié)構(gòu)信息丟失（削波），這將導(dǎo)致偽像的產(chǎn)生。 對(duì)于受激發(fā)射損耗數(shù)據(jù)是很難通過圖像重建恢復(fù)裁剪區(qū)域的丟失的信息，因此要避免削波是很重要的。
背景估計(jì)階段，用戶可以設(shè)置一個(gè)相對(duì)的或絕對(duì)的背景值。 如果背景被設(shè)置得太低，則軟件可能解釋更高的背景水平和噪聲的信號(hào)錯(cuò)誤地放大它們。 如果背景電平設(shè)置過高，真實(shí)的信號(hào)可以被忽略和壓制，這可能導(dǎo)致信息丟失。
圖11：反卷積的圖像與不同背景的絕對(duì)電平設(shè)置（原始圖像，背景= 0;背景= 15;背景= 30）。 不同的背景值顯示不準(zhǔn)確的估計(jì)的影響。 在過低的水平（0）的噪聲被解釋為信號(hào)而導(dǎo)致強(qiáng)偽影的產(chǎn)生，而高背景估計(jì)（30），使結(jié)構(gòu)信息丟失。
自動(dòng)估計(jì)值可以用兩種不同的算法來完成?！白畹汀?/em>搜索圖像為平坦區(qū)域具有最低的像素值，而“中/附近的對(duì)象”搜索對(duì)象，并確定在這些對(duì)象中的直接靠近的背景。 因此，“最低”的算法一般會(huì)產(chǎn)生較低的背景水平比“中/近對(duì)象”。 如果需要的話，還有一個(gè)選項(xiàng)，它允許用戶在“手動(dòng)”模式設(shè)置為自定義值。
解卷積階段
圖12：設(shè)置反褶積參數(shù)。
最大迭代次數(shù)：
在惠更斯默認(rèn)CMLE算法，在許多其他反卷積解決方案的理想形象的評(píng)價(jià)是做了幾個(gè)迭代。 更多的反復(fù)測(cè)試，更好的圖像將被反卷積。 在“反褶積強(qiáng)度”可以其特征對(duì)比度增強(qiáng)，并與原始圖像相比增加了分辨率。 與過高的信噪比設(shè)置組合使用過多的迭代可能導(dǎo)致偽影的產(chǎn)生。 預(yù)設(shè)的迭代次數(shù)被設(shè)置為40，用于共焦和受激發(fā)射損耗的圖像。信號(hào)噪聲比（SNR）：
信號(hào) - 噪聲比設(shè)置控制許多次迭代之后可達(dá)到的最大分辨率，因此，有對(duì)對(duì)象的清晰度的影響。
圖13：反卷積的圖像用不同的信號(hào) - 噪聲電平設(shè)置（原始圖像，SNR = 2; SNR = 12，SNR = 40）。 SNR值對(duì)對(duì)象的銳度的效果。 以低水平（2）的結(jié)構(gòu)似乎比在原始圖像稍大。 具有高SNR值（40）中的對(duì)象變得過分尖銳。 在這里，沒有結(jié)構(gòu)消失數(shù)值越高，不像在圖 11。
找到正確的SNR值有時(shí)是困難的。 標(biāo)準(zhǔn)值的10和15之間受激發(fā)射損耗范圍內(nèi)，但最好是檢查這些值真正適合。為此，線輪廓可以在整個(gè)圖像被創(chuàng)建（點(diǎn)擊并拖動(dòng)圖像上），以便估計(jì)在不同強(qiáng)度和本底水平。 對(duì)于信噪比估計(jì)，建議使用類似的背景值在背景估計(jì)步驟中輸入的那些。 默認(rèn)信噪比被設(shè)置為7，用于STED圖像和20，用于共焦圖象。
質(zhì)量閾值：
測(cè)量迭代之間的品質(zhì)指標(biāo)之差，并作為一個(gè)停止條件。 如果質(zhì)量指數(shù)顯示迭代之間沒有顯著的變化，去卷積過程停止。 這個(gè)值可以被使用，以避免不必要的重復(fù)。 默認(rèn)設(shè)置為0.05迭代模式：
明智的做法是保持這個(gè)在“ 優(yōu)化”。 欲了解更多詳情，請(qǐng)參閱本SVI用戶指南。磚布局：
明智的做法是保持這個(gè)在“自動(dòng) ”。 欲了解更多詳情，請(qǐng)參閱本SVI用戶指南。
整理步驟
圖14：經(jīng)過去卷積過程完成，該軟件提供給檢查去卷積的圖像，然后重新啟動(dòng)過程，如果需要的可能性。
在這些最后的步驟中，用戶有機(jī)會(huì)檢查所處理的圖像，并將其與原來的比較。 如果有必要，去卷積過程可以重新開始使用不同的參數(shù)和所有的圖片可終于出口回到“縮略圖一覽”窗口。
結(jié)論
現(xiàn)在，參與這一過程的參數(shù)的含義已被闡明，你會(huì)發(fā)現(xiàn)它更容易設(shè)置正確的值。 不過，也有一些基本的規(guī)則，這將確保可能的最佳結(jié)果：
運(yùn)行反褶積向?qū)е?，?qǐng)務(wù)必檢查在圖像屬性中的顯微鏡參數(shù)。
如果可能的話，產(chǎn)生的PSF（ 操作窗口 ）和形狀的圖像小的結(jié)構(gòu)比較和匹配相應(yīng)的飽和度因子和免疫部分。
如果可能的話，更喜歡小棧（至少3片），以單個(gè)幀。 三維數(shù)據(jù)產(chǎn)生顯著更好的去卷積圖像比2D數(shù)據(jù)。
總是去卷積圖像與原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以便在過程中，以排除可能的假象。 注意的是，如果結(jié)構(gòu)中去卷積圖像不會(huì)出現(xiàn)在原始數(shù)據(jù)，或者如果對(duì)象是小到單個(gè)像素。