尼康顯微鏡的激光共聚焦顯微鏡原理

 激光共聚焦掃描顯微技術(shù)（Confocal laser scanning microscopy）是一種高分辨率的顯微成像技術(shù)。普通的熒光光學(xué)顯微鏡在對(duì)較厚的標(biāo)本（例如細(xì)胞）進(jìn)行觀察時(shí)，來(lái)自觀察點(diǎn)鄰近區(qū)域的熒光會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于，每次只對(duì)空間上的一個(gè)點(diǎn)（焦點(diǎn)）進(jìn)行成像，再通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的一點(diǎn)一點(diǎn)的掃描形成標(biāo)本的二維或者三維圖象。在此過(guò)程中，來(lái)自焦點(diǎn)以外的光信號(hào)不會(huì)對(duì)圖像形成干擾，從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力。

 

圖1. 共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)化原理圖

圖1是一般共聚焦顯微鏡的工作原理示意圖。用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過(guò)入射小孔(light source pinhole)被二向色鏡(Dichroic mirror)反射，通過(guò)顯微物鏡(Objective lens)匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本(specimen)內(nèi)部焦點(diǎn)(focal point)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長(zhǎng)比較長(zhǎng)，直接通過(guò)二向色鏡并透過(guò)出射小孔(Detection pinhole)到達(dá)光電探測(cè)器(Detector)（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD）），變成電信號(hào)后送入計(jì)算機(jī)。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會(huì)被探測(cè)到。

 

圖2. 探測(cè)針孔的作用示意圖

 

圖2解釋了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的點(diǎn)所發(fā)出的光才能透過(guò)出射小孔；焦平面以外的點(diǎn)所發(fā)出的光線在出射小孔平面是離焦的，絕大部分無(wú)法通過(guò)中心的小孔。因此，焦平面上的觀察目標(biāo)點(diǎn)呈現(xiàn)亮色，而非觀察點(diǎn)則作為背景呈現(xiàn)黑色，反差增加，圖像清晰。在成像過(guò)程中，出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(diǎn)(focal point)是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系（共軛conjugate）,因而被稱為共聚焦（con-focal）顯微技術(shù)。 共聚焦顯微技術(shù)是由美國(guó)科學(xué)家馬文?閔斯基(Marvin Minsky)發(fā)明的；他于1957年就為該技術(shù)申請(qǐng)了**。但是直到八十年代后期，由于激光研究的長(zhǎng)足進(jìn)步，才使得激光共聚焦掃描顯微技術(shù)（CLSM）成為了一種成熟的技術(shù)。

 

圖3. 激光共聚焦顯微鏡原理框圖

 

當(dāng)今的激光共聚焦顯微鏡已經(jīng)發(fā)展為一種結(jié)合了激光技術(shù)，顯微光學(xué)，自動(dòng)控制和圖像處理等多種**科研成果的高技術(shù)工具。是現(xiàn)代微觀研究領(lǐng)域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信賴與創(chuàng)造”的一貫企業(yè)理念，正在為業(yè)界提供*水平的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)產(chǎn)品。

 

圖4. Nikon新一代A1激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)