尼康顯微鏡：共焦反射顯微鏡的基礎(chǔ)知識(shí)

當(dāng)許多生物醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為“共聚焦顯微鏡”，他們通常有熒光成像技術(shù)的初衷。 這個(gè)看似明顯的聯(lián)系，這是一個(gè)很好的理由。 大部分常見(jiàn)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用共聚焦顯微鏡利用光學(xué)切片功率，結(jié)合精湛的特異性免疫熒光或熒光原位雜交（FISH）乘標(biāo)記的細(xì)胞和組織產(chǎn)生更好的圖像。

可以利用共焦反射鏡，以收集更多信息相對(duì)點(diǎn)點(diǎn)額外的努力，因?yàn)閺臉?biāo)本的技術(shù)要求*低的樣品制備和儀器重新配置。 此外，未染色的組織的信息是現(xiàn)成的共焦反射鏡，作為數(shù)據(jù)標(biāo)記探針的組織反射光線。 該方法還可以結(jié)合使用，與比較常見(jiàn)的古典熒光技術(shù)。 后者的應(yīng)用程序的例子是在一個(gè)群體中的熒光標(biāo)記的細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)成像不透明的，圖案化的基質(zhì)上生長(zhǎng)，如在圖1中示出的熒光標(biāo)記的細(xì)胞之間的相互作用。

數(shù)字圖像在圖1（a）示出了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，小1微米高的支柱圖案，并使用反射共聚焦顯微鏡成像的硅基質(zhì)上生長(zhǎng)。 細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記紐（紅色）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，綠色）。 圖1（b）示出了類似的硅基質(zhì)上生長(zhǎng)的神經(jīng)元和標(biāo)記的抗體，該抗體，微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）和熒光素標(biāo)記的二次抗體。 同樣地，在硅基材的表面成像的共焦反射鏡。

生物醫(yī)學(xué)成像的共焦反射鏡的一個(gè)主要誘惑是的圖像無(wú)標(biāo)簽的活組織能力。 事實(shí)上，該技術(shù)已被利用的各種不同的組織中，包括腦，皮膚，骨，牙齒，眼組織的圖像。 共焦反射顯微鏡成像的眼的角膜和晶狀體的效果特別好，因?yàn)樗鼈兪峭该鞯摹?/span> 例如，光學(xué)部分已收集到客廳使用工作距離長(zhǎng)水浸泡目標(biāo)的角膜和晶狀體深400微米。

成像未染色標(biāo)本共焦反射鏡設(shè)計(jì)師早期焦工具螢光技術(shù)出現(xiàn)之前是非常常見(jiàn)的。 可以利用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）和尼普科夫旋轉(zhuǎn)盤(pán)顯微鏡，共聚焦反射模式。 旋轉(zhuǎn)盤(pán)顯微鏡的圖片可實(shí)時(shí)收集的，實(shí)際的顏色觀察，具有的優(yōu)點(diǎn)和不足，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)在激光掃描共聚焦顯微鏡的反射工件。 此工件出現(xiàn)在圖像中的一個(gè)亮點(diǎn)，從顯微鏡中的光學(xué)元件中的一個(gè)或多個(gè)反射所造成的。 反射的神器有幾種補(bǔ)救措施。 它可避免通過(guò)相差顯微鏡的光軸的亮點(diǎn)和縮放的幀掃描的區(qū)域中的試樣。 另外，反射可以從圖像中刪除數(shù)字中減去背景圖像的光斑或平場(chǎng)校正。 除去麻煩工件的另一種方法，應(yīng)用儀器，以消除從光學(xué)元件的反射偏振濾光器。

傳統(tǒng)的生物應(yīng)用廣角反射光成像，觀察生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)中使用的技術(shù)稱為反射干擾顯微鏡的蓋玻片上的細(xì)胞之間的相互作用。 這里，粘連細(xì)胞和它的基質(zhì)之間的界面處的玻璃蓋玻片和底面的細(xì)胞可見(jiàn)。 這些細(xì)胞粘附地區(qū)繼續(xù)成為一個(gè)研究領(lǐng)域的極大興趣。 與聯(lián)絡(luò)接觸相關(guān)的蛋白質(zhì)是利用免疫熒光分析，接觸本身可以被視為使用干擾反射鏡。

以類似的方式，使用共焦反射鏡觀察細(xì)胞基質(zhì)粘連，如在圖2中示出。 再次，蓋玻片和小區(qū)之間的界面成像。 該表面可以在共焦顯微鏡下難以定位，但在聚焦作為一種輔助手段，可以采用高反射率的蓋玻片。 細(xì)胞基質(zhì)接口可以位于集中在快速掃描模式，并出現(xiàn)粘連剛過(guò)蓋玻片明亮的閃光穿透細(xì)胞層時(shí)。 護(hù)理應(yīng)注意不要*載對(duì)焦時(shí)，以這種方式從非常明亮的蓋玻片表面的光電倍增管。

圖2給出了干擾反射共焦反射鏡技術(shù)拍攝的數(shù)字圖像。 圖2（a）示出了一個(gè)單一的光學(xué)部分雞的心臟成纖維細(xì)胞在細(xì)胞 - 基質(zhì)界面成像。 上面的外周的細(xì)胞接觸斑的暗條紋。 圖2中所示類似的單元格中的一項(xiàng)的 xz邊的（a）的圖2（b）中所示。 請(qǐng)注意，在圖2（b）的蓋玻片是非常光明的。 這似乎聚焦顯微鏡（紅色箭頭）時(shí)，閃光燈的閃光，細(xì)胞基質(zhì)接口后直接成像。

*近，使用相關(guān)技術(shù)，提高了圖像的絲狀偽足收集更反映基板上生長(zhǎng)的細(xì)胞從PC12細(xì)胞（大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤）。 的技術(shù)，稱為反向散射增強(qiáng)反射共焦顯微鏡 ，產(chǎn)生類似于收集使用傳統(tǒng)的微分干涉對(duì)比顯微鏡（DIC）的圖像。 使用這種方法，可以觀察未染色的細(xì)胞生長(zhǎng)在不透明的基質(zhì)，如硅芯片，是不可能的一種技術(shù)，它與傳統(tǒng)的透射光DIC成像。

使用反射光，而不是熒光，活細(xì)胞成像的優(yōu)點(diǎn)之一是沒(méi)有漂白文物的反射光模式。 還是應(yīng)該注意光損傷的活標(biāo)本的威脅，然而，和所有活細(xì)胞成像時(shí)的注意事項(xiàng)，應(yīng)采取。 已成功地利用共焦反射鏡， 在體外通過(guò)膠原基質(zhì)和膠原纖維形成，Z系列使用時(shí)間推移成像和隨后的三維重建（被稱為4-D成像）按照細(xì)胞遷移。 這些方法利用膠原蛋白的生物聚合物的高反射率或反照率。

共焦反射鏡（時(shí)相比，共聚焦熒光成像）的一個(gè)缺點(diǎn)是缺乏特異性探針的差異反映多個(gè)標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)。 這是很難改進(jìn)的多波長(zhǎng)的探針，可用于免疫熒光和活細(xì)胞成像。 探頭，可用于在反射光模式為單個(gè)標(biāo)簽的實(shí)驗(yàn)包括金顆粒，過(guò)氧化物酶標(biāo)簽，和銀顆粒。

作為一個(gè)例子，共焦反射鏡原位雜交（圖3）制備試樣的放射自顯影成像銀顆粒比傳統(tǒng)的明或暗視野顯微鏡提供了顯著的改善。 該out-of-的聚焦信號(hào)從整個(gè)乳狀液中的銀顆?？梢杂行У叵c核糖核酸探針的光學(xué)切片的乳液使用共焦反射鏡的銀顆粒，從焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的圖像。

如圖3所示的幾個(gè)數(shù)字圖像采集共焦反射鏡的實(shí)驗(yàn)與銀顆粒。 標(biāo)本外周血細(xì)胞原位雜交，用姬姆薩染色準(zhǔn)備從艾滋病毒感染的個(gè)體。 圖3（a）示出制備根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)明照明，而圖3（b）顯示了相同的暗場(chǎng)照明領(lǐng)域中有顯著量的焦點(diǎn)外的碎片。 共焦反射鏡（在同一視場(chǎng)）的結(jié)果列于圖3（三）。 需要注意的是還沒(méi)有在此模式下成像的焦點(diǎn)外的碎片。 為了比較的目的，樣品也可以用微分干涉對(duì)比成像，在明場(chǎng)和暗場(chǎng)照明。

因?yàn)槭占姆瓷涔獾墓簿劢箞D像和所發(fā)送的圖像（明場(chǎng)和暗場(chǎng)）同時(shí)使用相同的掃描激光束（在圖3），它們是在與另一個(gè)寄存器，并可以進(jìn)行數(shù)字合并成單個(gè)圖像。 的透射光的明視場(chǎng)圖像記錄的總的細(xì)胞種群，無(wú)論是作為一個(gè)灰度圖像或真彩色圖像（提供了一個(gè)真正的顏色的透射光檢測(cè)器被安裝在顯微鏡）。 暗場(chǎng)照明圖像采用了銀顆粒在完整的乳液，包括任何污染的玻璃表面上的塵埃顆粒的整個(gè)人口的信號(hào)。 反射共焦顯微鏡圖像，與此相反，只記錄標(biāo)記的探針（圖3（c））的那些細(xì)胞，并因此比透射光圖像的標(biāo)記的細(xì)胞是更準(zhǔn)確的測(cè)量。 此外，它是更適合于探頭的量化，因?yàn)樵搱D像由黑色背景上的飽和像素（信號(hào)從探頭）的離散區(qū)域，有點(diǎn)讓人想起在這方面的熒光圖像。

共焦反射顯微鏡圖像數(shù)字合并透射光圖像顯示目的，標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞總?cè)丝诘墓烙?jì)數(shù)。 在大多數(shù)共聚焦系統(tǒng)中，收集在一個(gè)通道的RGB圖像（通常是藍(lán)色通道）的透射光圖像，反射光圖像，熒光圖像或一個(gè)或多個(gè)與它同時(shí)被收集，通常成紅色綠色通道。 顯示以這種方式產(chǎn)生的透射光圖像的彩色背景上，在圖4（a）所示，一個(gè)典型的明場(chǎng)或DIC圖像或黑色背景上的暗場(chǎng)圖像的灰度級(jí)，而不是更熟悉的梯度。 將其粘貼到一個(gè)不同的層上使用的數(shù)字圖像編輯程序，例如Adobe PhotoShop的（在圖4（b）所示）的反射光圖像，可以通過(guò)以下方式獲得的透射光圖像的一個(gè)更為現(xiàn)實(shí)的版本。

除了熒光共焦反射鏡通常采用添加熒光圖像中查看時(shí)，隔離（特別是共焦熒光圖像，它可以包括幾個(gè)白色的像素上的黑色的海洋），它可以是相當(dāng)抽象的上下文。 在上面給出的示例中，結(jié)合的特異性標(biāo)記，免疫熒光和共聚焦顯微鏡的光學(xué)切片功率實(shí)際上可以妨礙的圖像本身的解釋，除非它們被數(shù)字合并的反射光，透射光或反染熒光圖像。

共焦反射鏡雖然有有限的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)成像，它有時(shí)可以提供額外的信息，從樣本反射光線或有重大波動(dòng)的折射率在一定的邊界。 這種有用的技術(shù)，用透射光成像，可能是值得一試的熒光標(biāo)記成像時(shí)，用共聚焦顯微鏡標(biāo)本。