尼康顯微鏡：全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)的結(jié)構(gòu)
在熒光顯微鏡應(yīng)用中通常采用的各種機制限制熒光團的激發(fā)和檢測的樣品的薄區(qū)域。 消除從焦平面以外的背景熒光，顯著提高的信號噪聲比，并因此，空間分辨率的功能或感興趣的事件。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）利用感應(yīng)的倏逝波或場的有限的試樣區(qū)域，緊鄰兩個具有不同折射率的介質(zhì)之間的界面的**性能。 在實踐中，*常用的接口在應(yīng)用程序中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡的試樣和玻璃蓋玻片或組織培養(yǎng)容器之間的接觸面積。
TIRFM的基本概念并不是新的，和*近的興趣和熱情，技術(shù)已經(jīng)到來，由于技術(shù)進步，促進其使用。 可用的完整的準備使用的儀器儀表系統(tǒng)的方法，以及在熒光基團的技術(shù)，比如基因編碼的熒光物種，發(fā)展就業(yè)使人們有可能在直接調(diào)查細胞膜和其它表面處理的數(shù)這在以前是不可能的方式。
TIRFM的物理基礎(chǔ)
全內(nèi)反射（TIR）的物理現(xiàn)象已依賴在這種看似不同應(yīng)用現(xiàn)代光纖的數(shù)據(jù)傳輸，并在百年歷史的鉆石切割利用率提高，切割的寶石閃閃發(fā)光，或“火”。 在每一種情況下，光的折射（或彎曲），當它遇到禁閉的一部分或全部的光的高折射率介質(zhì)具有不同折射率的兩種介質(zhì)之間的界面（n）的結(jié)果。 甲準直光束通過一種介質(zhì)傳播，達到這樣的接口可以是折射的，因為它進入第二介質(zhì)的界面處反射，取決于入射角，并在兩種介質(zhì)的折射率的差異。 全內(nèi)反射是*可能的情況下，在其中傳播的光遇到低的折射率的介質(zhì)的邊界。 其屈光的行為是由斯涅耳定律：
n(1)×SINθ(1)=n(2)×SINθ(2)
其中，n（1）較高的折射率和n（2）的折射率低。 ，相對于界面法線與入射光束的角度θ（1）表示的，而折射光束角由下式給出θ（2）內(nèi)的低折射率介質(zhì)。 當光照射該接口的兩種材料在足夠高的角度，稱為臨界角（θ（c）），它的折射方向成為平行接口（相對于法線90度），它被反射在較大的角度完全返回到*介質(zhì)。
雖然光不再傳遞到所述第二介質(zhì)中時，它是在大于臨界角的角度入射時，反射光產(chǎn)生一個高度受限制的電磁場的界面附近，在較低折射率的介質(zhì)中。 這漸逝場對入射光的頻率是相同的，因為它在強度與界面的距離呈指數(shù)衰減，該字段在*多幾百納米到試樣在z方向 （垂直接口）延伸。 在一個典型的實驗裝置中，在液體的玻璃或塑料液體表面附近的熒光基團，分布可以激發(fā)出的漸逝場，只要它們有潛在的電子躍遷的能量范圍內(nèi)或非常接近的照明光束的波長帶寬。 由于漸逝場強度呈指數(shù)衰減，熒光團的激發(fā)是受限制的區(qū)域，這是典型的，厚度小于100納米。 通過比較，該光學部分的厚度是約十分之一，所產(chǎn)生的共焦熒光顯微技術(shù)。 避免因為大量的試樣的熒光團的激發(fā)，次級熒光發(fā)射限制到一個非常薄的區(qū)域，來實現(xiàn)高得多的信號對噪聲比較傳統(tǒng)的寬視場落射熒光照明。 這種增強的信號電平，使得它可以通過內(nèi)全反射螢光顯微方法檢測單分子熒光。
全內(nèi)反射熒光的基本概念，是示意性地示出在圖1中，試樣的細胞結(jié)合的熒光分子（圖中的綠色的熒光基團），其中在玻璃顯微鏡載片上的支持。 在載玻片試樣介質(zhì)水溶液（約1.35）（1.518）的折射率適當?shù)刂С秩珒?nèi)反射，在玻璃載片上。 調(diào)整激光激發(fā)的值大于臨界角的入射角，照射光束被完全反射回時遇到的接口到顯微鏡載片上，緊接該接口相鄰的檢體介質(zhì)中產(chǎn)生漸逝場。 *接近的玻璃表面的熒光基團被選擇性地激發(fā)的相互作用的漸逝場中，可以收集從這些發(fā)射器的二次熒光顯微鏡的光學系統(tǒng)。
正如先前所討論的，所采取的不同介質(zhì)之間的界面處的折射或反射后傳播的光束的角度取決于光的入射角的界面處，以及這兩種材料的折射率。 發(fā)病率，*過該發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角，可以計算由斯涅耳定律的表達操縱，上面給出的。 應(yīng)用方程細胞膜的過程的一個典型的生物調(diào)查，載玻片或蓋玻片的折射率由n（1）（約1.5）表示，而n（2）表示的折射率的緩沖水溶液或細胞質(zhì)組件（1.33至1.38）。 具有n（1）比n（2），當θ（1）*過臨界角θ（三），會發(fā)生全內(nèi)反射在玻璃介質(zhì)。 上面的臨界入射角，折射發(fā)生在90度（罪θ（2）=1），斯涅耳定律簡化為：
n（1）×SINθ（C）= n（2）
或
SINθ（C）=n(2)/ n（1）
因此，在臨界角可以表示為：
θ（C）=sin-1 N（2）/ N（1）
不突然發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角成為一種新現(xiàn)象，但隨后用少量的反射，*過臨界角時，總反射從主導(dǎo)折射的連續(xù)過渡。 朝著臨界角值隨著入射角的增大，傳輸（折射）光束反射光束強度減弱，而變得更加**。 在所有大于臨界角的角度，總的內(nèi)部反射來實現(xiàn)，其中基本上所有的光被反射回所述*介質(zhì)。 即使不再光傳播到所述第二介質(zhì)中，有少量的反射光通過該接口，然后平行于表面的傳播，創(chuàng)建一個電磁場在緊接該接口相鄰的第二介質(zhì)的滲透。 這個字段是被稱為漸逝場，并在有限的界面附近的區(qū)域，它是能夠令人興奮的熒光基團。 在z方向上（垂直于界面）的指數(shù)衰減的倏逝波的能量激勵的范圍是有限的。 下面的公式定義這種能量的距離的函數(shù)，從該接口：
E（Z）= E（0）exp（-z/d）
其中，E（z）是在從接口的垂直距離 z和E的能量（0）是在界面處的能量。 的穿透深度（d）不依賴于入射照明光的波長（λ（i））的入射角，和在界面處的折射率的介質(zhì)，根據(jù)公式：
在小的入射角，通過該接口的較低折射率介質(zhì)傳播的光波的正弦，有一個特征周期。 在增加角度，接近臨界值，這個時期的折射光線變長，變得更接近平行于界面的傳播方向。 當達到臨界角，波周期變得無限大，折射光的波陣面垂直于界面的表面對齊。
要總結(jié)，有幾個關(guān)鍵因素支配的倏逝波在顯微鏡的利用率。 全內(nèi)反射的發(fā)生，并且產(chǎn)生的漸逝場中的照明發(fā)病率的介質(zhì)的折射率必須是大于檢體介質(zhì)（比n（2），N（1）），光的入射角（θ （1））必須是大于臨界角（θ（c） ）。 入射照明光波長的影響倏逝波的穿透深度和特定的被激發(fā)的熒光基團，其中必須有適當?shù)奈仗匦缘?a title='光源' target='_blank' class='seolabel'>光源的波長帶中。 的含意結(jié)合的倏逝波的能量呈指數(shù)下降的事實，在z方向上的波長的影響，可以誘導(dǎo)在一個非常薄的光學部分，通常小于100納米的厚度，高度特異性熒光激發(fā)。 盡管是有限的全內(nèi)反射螢光顯微鏡成像具有合適的折射率的兩種不同介質(zhì)的界面處，大量的應(yīng)用是非常適合的技術(shù)。 在生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究興趣是*活躍的領(lǐng)域之一，其中許多引人注目的問題涉及過程發(fā)生在細胞表面或血漿膜 - 適當?shù)慕涌赥IRFM調(diào)查。
TIRFM基本儀器的方法
有兩種基本的方法配置儀器的全內(nèi)反射熒光顯微鏡：棱鏡法 ，和物鏡方法 。 圖2說明了這兩個配置。 在棱鏡技術(shù)，聚焦的激光束被引入到顯微鏡蓋玻片通過附在其表面上的棱鏡，光束入射角被調(diào)整到臨界角（參見圖2（a））。 依賴引進光束在棱鏡有許多限制，主要是由于到標本操縱的幾何約束，盡管該方法在生物應(yīng)用已動用*過二十年，它從來就沒有成為一個主流研究工具。 棱鏡配置有許多變化，但大多數(shù)限制訪問試樣，使其難以執(zhí)行操作，注入介質(zhì)入檢體空間，或進行生理測量。
棱鏡技術(shù)的另一個缺點是倒置顯微鏡設(shè)計的基礎(chǔ)上，在大多數(shù)配置中，被引入的照明在試件上的相反側(cè)的目標的光學元件，需要通過大量的試樣的漸逝場區(qū)域成像。 放置棱鏡的標本，以避免這種情況的客觀方面提出更多的問題，因為靠近一個短工作距離目標的標本和棱鏡位置。配置利用全內(nèi)反射成像系統(tǒng)的復(fù)雜性和精度要求阻礙了許多潛在的研究人員從顯微鏡制造商提供完整的系統(tǒng)（“交鑰匙”）成為前。 需要調(diào)查誰想要利用技術(shù)，設(shè)計并建立自己的系統(tǒng)，這個困難，結(jié)合的必要性，建立和維護一個開放的激光光學平臺上，這意味著更早版本的用戶更經(jīng)常棱鏡方法物理學家比生物學家。
所述物鏡的技術(shù)，它有時也被稱為通過透鏡照明 ，避免了許多設(shè)計上的限制，利用這樣的棱鏡引入光在所要求的角度（參見圖2（b））。 在該方法中，客觀上介紹無論是相干激光或蓋玻片試樣界面的非相干弧燈照明。 的入射角大于臨界角的實現(xiàn)通過使用高數(shù)值孔徑的目標（理想情況下為1.45或更高）。 通常情況下，被認為是一個客觀的數(shù)值孔徑的特征的光收集能力的鏡頭。 相反，直接的數(shù)值孔徑?jīng)Q定的角度范圍內(nèi)的光可以退出該目標時，它是利用一個提供照明。 數(shù)值孔徑和可實現(xiàn)的照明的入射角之間的關(guān)系由下面的公式描述：
數(shù)值孔徑（NA）= n×sin（θ）
其中，NA是物鏡的數(shù)值孔徑，n表示折射率，θ是二分之一的物鏡的孔徑角。 結(jié)合上面給出的全內(nèi)反射條件的關(guān)系，示出該活細胞具有典型的折射率為1.38需要一個客觀的，具有大于1.38的數(shù)值孔徑，以實現(xiàn)全內(nèi)反射的照明。 光線進入的目標必須通過的孔徑錐部對應(yīng)于數(shù)值孔徑大于1.38的值，以上面的玻璃試樣界面被全反射。 如果采用相干激光照明，它必須集中在目標后孔的周邊，保證燈將退出上面的角度等于或大于臨界值的前面的光學表面。 在非相干照明，例如以從一個弧放電燈的情況下，在一個不透明的磁盤的形式的掩模必須被引入到光路中，以限制的目標的光通過后孔的外部區(qū)域。
通過限制在物鏡的后焦平面的圓形環(huán)隙區(qū)域的照明，照明錐的中心的光線，通常會出現(xiàn)在亞臨界角被擋。 由此產(chǎn)生的排放物的目標是一個中空的圓錐體入射的光的后半的角度足以造成全內(nèi)反射的TIR接口。 如果顯著的照明的目標后孔（較低的數(shù)值孔徑區(qū)域）的中央部通過，落射照明，而不是全內(nèi)反射，降低在圖像平面上的信號 - 噪聲比。 在實踐中，不透明的阻光磁盤可以被安裝在一個可移動的滑塊，促進TIRF和落射照明成像模式之間快速切換。
實現(xiàn)漸逝場激發(fā)通過使用高孔徑物鏡，在試樣的操作和測量選項提供了更大的靈活性比棱鏡為基礎(chǔ)的技術(shù)，但入射照明角度的精確控制是比較困難的。 當一激光源，用于耦合到棱鏡的光的入射的角度可以很容易地在很寬的范圍內(nèi)變化，可以簡單的控制的漸逝場的穿透深度。 與物鏡系統(tǒng)，在客觀的后側(cè)焦點面上的激光的聚焦點的偏軸（利用的開口的外周部），和從透鏡軸的徑向距離增加，產(chǎn)生一個相應(yīng)的角度的增加，在光入射到試樣上的（參見圖3）。
如果物鏡的數(shù)值孔徑足夠大，則可以實現(xiàn)全內(nèi)反射的臨界角。 ，因為主要的細胞成分（細胞質(zhì)中）具有約1.38的折射率，物鏡的數(shù)值孔徑*過該值是必需的。 只有百分之幾的鏡頭的周邊區(qū)域有一個1.4的數(shù)值孔徑的目標，可以利用全內(nèi)反射的臨界角的只能稍微*過，進入后孔的一個非常具有挑戰(zhàn)性的程序耦合的激光。 顯然，更高的數(shù)值孔徑的目標是有利的，并提供額外營運利潤率*過臨界角的角度微調(diào)。 一旦*過臨界角時，鏡頭的光軸的激光焦點的徑向距離的進一步增加，以減少在一個光滑的和可重復(fù)的方式漸逝場的穿透深度。
TIRFM應(yīng)用
在一般情況下，總的內(nèi)部反射照明具有潛在的好處，在任何應(yīng)用程序需要標本中有大量的熒光基團位于分子在溶液中的布朗運動的興趣愛好，如光學平面以外的微小結(jié)構(gòu)或單分子成像，囊泡發(fā)生內(nèi)吞作用胞吐，或單細胞蛋白質(zhì)販運。 這樣的樣本通常表現(xiàn)出急劇增加，信號噪聲比的限制，激發(fā)區(qū)域的厚度。 圖4表示的利用TIRFM技術(shù)方法（圖4（b））和常規(guī)落射熒光照明（圖圖4（d））的溶液的熒光微球獲得的圖像。 到左邊的每個圖像是其對應(yīng)的的強度直方圖（圖4（a）和圖4（c））。 在影像中，在尖銳的本地化和較高的信號強度在直方圖中對應(yīng)的全內(nèi)反射螢光顯微鏡圖像（圖球體從1.3到35所提供的信號-噪聲比（S / N）增加分辨率的提高是明顯的圖4（a））。
人們很早就認識到，全內(nèi)反射螢光顯微鏡在回答了一些生物的問題可能會成為一個**的工具，雖然使用了20多年，該技術(shù)已得到了相當多的關(guān)注，直到*近。 電池基板接觸人體皮膚成纖維細胞，標記用熒光血脂，TIRFM在20世紀80年代初進行了調(diào)查。 在大約相同的時間利用TIRFM技術(shù)的組合進行的另一項研究中，用熒光漂白恢復(fù)（FRAP）澄清生物分子的表面動力學，同時仍然集中在綁定到表面的能量轉(zhuǎn)移的牛血清白蛋白。 結(jié)合，后者的研究的TIRFM與熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），另一種技術(shù)，目前正經(jīng)歷著快速增長的應(yīng)用程序。
TIRFM和其他**技術(shù)更多地利用的趨勢是由于供應(yīng)量增加，使得它不必要的工程師，為每個特定的研究應(yīng)用，并構(gòu)建定制系統(tǒng)*的模塊化儀器。 另一個重要因素是，可以適用于各種各樣的問題，其中*重要的，這可能是利用綠色熒光蛋白（GFP），青色，藍色，黃色和紅色的衍生物的多功能生物工具的發(fā)展。 來源于水母的綠色熒光蛋白，不要求種屬特異的輔助因子表達和展覽的熒光，可用于跨物種實驗。 生物的熒光基團已被插入到數(shù)百蛋白質(zhì)，通過基因重組，并且本質(zhì)上是無限的，潛在的。 另一個有希望的GFP突變體的發(fā)展能力的結(jié)果作為神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中的細胞內(nèi)鈣指標的功能。 這些蛋白質(zhì)已監(jiān)測在一些研究中，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
TIRFM是一個理想的工具，進行調(diào)查的機制和動力，許多參與細胞 - 細胞相互作用的蛋白質(zhì)。圖5給出比較圖像的活細胞（PtK1袋鼠腎上皮細胞表達GFP-紐）利用傳統(tǒng)的廣角落射熒光法（圖5（A））和漸逝波照明（圖5（b））。 TIRFM圖像顯示融合蛋白在細胞粘著斑由平面熒光落射照明圖像產(chǎn)生模糊的巨大反差的是在襯底界面的本地化。 活細胞成像代表TIRFM技術(shù)*有前途的應(yīng)用之一。 蛋白在細胞膜表面的相互作用，如涉及焦點粘連，它具有極大的重要性，在細胞生物學。 理解正常的細胞生長和其衰減造成的細胞 - 細胞接觸（接觸抑制）中所涉及的信號可以提供異常細胞的生長中發(fā)生的疾病，如癌癥的洞察。
生物分子水平的，全內(nèi)反射螢光顯微鏡技術(shù)已被用于圖像的突變蛋白的GFP-消旋販賣沿薄絲狀偽足的細胞生長在基板上（圖6）的單分子。 這種蛋白是參與細胞運動，其在細胞膜的相互作用的動力學的知識是至關(guān)重要的了解的過程。 有足夠的時間分辨率動態(tài)研究的可視化單分子熒光TIRFM，因為懸而未決的倏逝波激發(fā)所帶來的信號噪聲比。 圖6給出的四個連續(xù)時間的推移在200毫秒的時間間隔拍攝的幀，示出了運動的GFP-Rac的融合蛋白分子（箭頭）通過細filopodium的一個爪蟾的細胞生長在襯底上。
TIRFM雖然是有限的調(diào)查蓋玻片標本接口或附近發(fā)生的結(jié)構(gòu)和流程，它是目前在生物和生物醫(yī)學科學的興趣，很多問題可以探討在細胞膜同時偶然。 神經(jīng)科學領(lǐng)域的許多根本問題借給自己TIRF顯微鏡研究。 應(yīng)用該技術(shù)的一個理想的候選人是在突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和吸收的研究。 從歷史上看，膜販運和融合的機制，包括突觸囊泡釋放（胞吐）或攝?。▋?nèi)吞作用），已使用遺傳，生化，電子顯微方法研究。 這些技術(shù)在某些方面是間接的，或僅提供一個瞬時表示所發(fā)生的程序，無法解析的細胞膜活性的復(fù)雜動態(tài)。
膜片鉗技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)允許電容測量可用來指示，由非常小的電變化，膜表面積或氧化物質(zhì)的釋放的加法或減法。 這種技術(shù)的缺點是，只有融合事件被檢測到，和高時間分辨率的同時，可以實現(xiàn)，有很少的重要事件的空間位置上的信息。 由于所有的事件一起被檢測到，得到無特異性和囊泡運輸對接，和膜融合的其他階段的細節(jié)通常被結(jié)合動力學模型推斷，從小區(qū)的測量。 雖然電子顯微鏡調(diào)查提供了出色的空間分辨率，活細胞或動態(tài)的研究是不可能的，與其他測量瞬時意見的相關(guān)性是非常困難的。 強度的TIRFM方法，證明在*近的調(diào)查中，可能是直接肉眼觀察動態(tài)囊泡蛋白相互作用。
TIRFM由于個別囊泡光學解決，按照它們之間的相互作用，直接動態(tài)的能力，提供了*的大量的蛋白質(zhì)參與的方式在神經(jīng)生物學過程研究的能力。 *近的一項研究表明釋放的熒光脂質(zhì)含有突觸船只活動區(qū)域，以及隨后從儲備庫位于20納米從質(zhì)膜提供補充盜號木馬的囊泡運輸?shù)摹?/span> 另一項研究涉及直接可視化培養(yǎng)的肥大細胞的內(nèi)吞作用的動態(tài)過程中肌動蛋白的作用。 GFP-肌動蛋白絲，觀察周圍的熒光標記的胞飲囊泡，進入細胞內(nèi)的肌動蛋白的流中拉出。 一時間推移TIRFM成像序列圖7說明GFP-肌動蛋白的內(nèi)吞過程中。 的6個連續(xù)的幀表示在0到65秒的范圍內(nèi)的不同的時間間隔。 在每個幀中的白色箭頭表示的GFP-肌動蛋白的融合蛋白的信號。
在圖8中示出的多光譜成像囊泡-肌動蛋白的內(nèi)吞作用過程中的相互作用。 在這兩個通道的圖像（圖8（a）），一個流的綠色標記的GFP - 肌動蛋白被認為是在細胞外介質(zhì)中的囊泡含有德克薩斯紅葡聚糖周圍。 一時間的推移三個雙通道圖像序列（圖8（b）至8（d）條）提供了洞察時間動態(tài)的肌動蛋白囊泡的胞飲過程中的互動。 這種類型的研究邏輯上可以擴展標記突觸蛋白，利用不同的GFP顏色的變種，以調(diào)查他們的互動和動態(tài)。
雖然試樣中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡中成像在二維空間中，有可以得到在細胞的囊泡或結(jié)構(gòu)上的位置的三維信息的機制，其中，無論是在活細胞研究和在固定染色制劑。 圖9示出了在細胞結(jié)構(gòu)蛋白的微管蛋白的免疫細胞化學標記，想像同時使用寬視場落射熒光（圖9（a））和瞬逝波照射（圖9（b））。 結(jié)構(gòu)的細節(jié)揭示在TIRFM技術(shù)的圖像，不能進行可視化與常規(guī)落射照明。 比較兩個圖像模式所強調(diào)的是覆蓋在偽。 在圖9中（C），螢光分配的顏色為綠色，而TIRFM圖像顯示為紅色。
全內(nèi)反射螢光顯微鏡的原理，通過改變照明的入射角，并因此對倏逝波的穿透深度，熒光基團可以被區(qū)分納米尺度上的深度。 這種技術(shù)可以精確地控制穿透深度更容易棱鏡類型的系統(tǒng)中來完成的，*近的技術(shù)改進的方法是利用聲-光偏轉(zhuǎn)器（AOD），快速地改變?nèi)肷浣恰?/span> 在漸逝場深度的快速變化，目標囊泡或其他結(jié)構(gòu)可以跟蹤在不同的深度和準確地確定它們的位置。有很多方向AOD中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡，包括用作極快的快門，可以快速地調(diào)節(jié)照明波長的多線式激光裝系統(tǒng)的潛在的有用的應(yīng)用程序。
如上所討論的，在目標為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中的入射角的變化是不容易在使用棱鏡來完成，雖然新的更高的數(shù)值孔徑的目標提供了相當大的改進，在可用的范圍內(nèi)的入射角調(diào)整。 在一般情況下，目標類型的系統(tǒng)能夠檢測更多的發(fā)射光，并且這個信號的強度隨距離單調(diào)減小。 該屬性是一個優(yōu)勢，在校準的TIRFM技術(shù)的系統(tǒng)，可以使熒光信號電平有關(guān)的軸向位置，提供了另一種方法，三維成像。
未來發(fā)展前景
TIRFM的基本理論，現(xiàn)在成立，*近的技術(shù)進步大大促進了該技術(shù)已實際執(zhí)行。 因此，越來越多的生物分子和細胞生物學的調(diào)查正在使用的技術(shù)進行。 TIRFM技術(shù)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上直立或倒置顯微鏡是相對簡單的，使用的激光光源，并且可以通過使用傳統(tǒng)的弧燈源，如果進行了修改，以阻止光通過的中央?yún)^(qū)域的目標。 TIRFM配置與其他光學技術(shù)結(jié)合，完整的模塊化顯微鏡系統(tǒng)，現(xiàn)在，有的廠家專門為內(nèi)部反射的應(yīng)用提供了高數(shù)值孔徑物鏡。 具有廣泛的照明模式，包括明，暗場，相襯和微分干涉對比，以及常規(guī)落射熒光的內(nèi)全反射螢光顯微技術(shù)兼容。 的目標為基礎(chǔ)的系統(tǒng)的一個特別的優(yōu)點是，它們可以被用來結(jié)合用于處理生物分子的各種機制，如原子力顯微鏡。 它很可能是全內(nèi)反射螢光顯微鏡將繼續(xù)被合并與其他技術(shù)互補。
收購在活細胞在多個波長的高時空分辨率的圖像數(shù)據(jù)是一個面積的TIRFM大有希望，一定要更詳細地比以前一直未能揭示細胞動力學和擴大利用各種染料組合。 *近，研究者已經(jīng)報道利用雙發(fā)射波長檢測，可以在一個單一的波長激發(fā)的熒光基團，并通過配置系統(tǒng)的多波長激發(fā)TIRFM能力進一步擴大的可能性是存在的。 單分子研究，將大大提高染料特性的進一步發(fā)展和持續(xù)改進的探測器。 在細胞研究的TIRFM方法的擴展可能繼續(xù)通過細化的遺傳和分子操縱技術(shù)，結(jié)合所提供倏逝波激發(fā)的高時空分辨率的光學檢測。
TIRFM和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）由于有一定的通用功能，這兩種技術(shù)進行評估時，自然比較可能的方法來研究問題。 雖然這兩種技術(shù)提供了光學切片能力，全內(nèi)反射螢光顯微鏡的方法是有限的試樣區(qū)域，具有一個合適的折射率界面，而共聚焦顯微鏡可以選擇性圖像幾乎任何試樣平面。 然而，共聚焦方法所產(chǎn)生的*小的光學部分的厚度是約600納米 - 厚度大于100納米的部分的內(nèi)全反射螢光顯微技術(shù)的典型。 在許多應(yīng)用中，它是希望到標本（減輕細胞損傷，例如），以盡量減少總的照明通量，因為共聚焦工具照亮一個比較大的標本量，這是與全內(nèi)反射螢光顯微鏡更容易地完成。 在一般情況下，它是更經(jīng)濟的配置TIRFM技術(shù)的儀器，它不需要復(fù)雜的掃描系統(tǒng)，可以建在幾乎任何現(xiàn)代光學顯微鏡研究級。 完整的，配置系統(tǒng)的一些廠家所提供的是*直接的進入點TIRFM技術(shù)，并允許其他**的光學成像模式的綜合能力。
d = λ(i)/4π × (n(1)2sin2θ(1) - n(2)2)-1/2