徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡介紹

2020-09-04 09:55:12

熒光顯微鏡的光學(xué)顯微鏡是一種特殊形式。它使用目標(biāo)波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射光的熒光染料的能力。蛋白質(zhì)的利益可以通過(guò)抗體染色或熒光蛋白標(biāo)記的熒光染料標(biāo)記的。它允許一個(gè)單一分子物種的分布的測(cè)定，其量和其在細(xì)胞內(nèi)的本地化。此外，可以進(jìn)行共定位和相互作用的研究，觀察到的離子濃度，使用可逆地結(jié)合染料，如Ca 2 +和呋喃-2和內(nèi)吞作用和胞外分泌的細(xì)胞過(guò)程，如觀察。今天，它甚至可以將圖象分的幫助下，熒光顯微鏡的分辨率的顆粒

斯托克斯位移

熒光的一個(gè)重要特點(diǎn)是斯托克斯位移。它描述了一個(gè)令人興奮和發(fā)射的光子的能量水平的差異。由熒光發(fā)射的光子是一個(gè)令人興奮的光子的波長(zhǎng)比更大。這是由于被激發(fā)后的熒光染料，但在此之前發(fā)射的光子的能量釋放到周圍環(huán)境中。由此產(chǎn)生的波長(zhǎng)偏移，使得它可以令人興奮的和出射光之間的區(qū)分。可以被看作是具體特征的分子物種的吸收和發(fā)射的能量。

熒光顯微鏡

直立或倒置熒光顯微鏡（）是類似于一個(gè)普通的光學(xué)顯微鏡下，除了用激光為單色光或水銀燈或氙弧燈像一個(gè)充滿生機(jī)和**的光源提供照明。此外，它還包含一個(gè)激勵(lì)濾波器和發(fā)射濾波器。激發(fā)濾光片傳輸只能夠激發(fā)試樣，用其特定的染料的光。由樣品發(fā)射的光到達(dá)檢測(cè)器之前，通過(guò)發(fā)射濾光片。由樣品發(fā)射的光到。只與一個(gè)不同的波長(zhǎng)的光的透光性，例如由試樣發(fā)出的光的發(fā)射濾光片

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圖 1：通過(guò)熒光顯微鏡的光路

 

近年來(lái)，發(fā)光二極管（發(fā)光二極管）也被用作光源，用于熒光顯微鏡。由LED發(fā)射的光的波長(zhǎng)取決于用于生產(chǎn)的材料。然而，在大多數(shù)情況下，需要的激發(fā)光濾光片，因?yàn)長(zhǎng)ED通常在一個(gè)相當(dāng)寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光。

大多數(shù)熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡。照明器和物鏡被定位在試件的同一側(cè)，并通過(guò)試樣的光不通過(guò)。除了激發(fā)和發(fā)射濾光片，分色鏡，需要為這種熒光顯微鏡。甲二向色反射鏡，使目標(biāo)波長(zhǎng)的光通過(guò)，而其他波長(zhǎng)的光被反射。過(guò)濾器和分色鏡經(jīng)常一起插入在過(guò)濾器中的多維數(shù)據(jù)集。

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激發(fā)光通過(guò)激發(fā)光濾光片和分色鏡。這反映了對(duì)試樣的光通過(guò)物鏡。標(biāo)本中的興奮和熒光染料發(fā)出的光子。這個(gè)發(fā)射光線通過(guò)客觀的分色鏡。所發(fā)射的光具有適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，并且能夠通過(guò)。由試樣反射的激發(fā)光，無(wú)法通過(guò)二向色鏡，會(huì)被阻塞。如果激發(fā)光能夠通過(guò)分色鏡將被阻塞，當(dāng)它到達(dá)發(fā)射濾光片。可以測(cè)量的檢測(cè)器的發(fā)射過(guò)濾器的光通過(guò)。 

在熒光顯微鏡中使用不同類型的過(guò)濾器。帶通，長(zhǎng)傳和短通濾波器可以區(qū)分的。傳輸?shù)念l帶的波長(zhǎng)帶通濾波器，而具有更大或更小的波長(zhǎng)的光將被阻止。長(zhǎng)傳和短通濾波器邊緣過(guò)濾器。長(zhǎng)通濾波器的長(zhǎng)波長(zhǎng)的光傳輸。與目標(biāo)的截止值以上的波長(zhǎng)的光將無(wú)法通過(guò)。相比之下，短通濾波器傳輸短的波長(zhǎng)，并阻止長(zhǎng)

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圖 3，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎

 

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圖 4：熒光原位雜交染色體。紅色：TRITC，藍(lán)色：CY5，綠色：FITC

 

在熒光顯微鏡中的不同的技術(shù)

熒光顯微鏡被廣泛使用，并提供了巨大的特異性。的各種技術(shù)使人們有可能以解決不同的問(wèn)題，甚至規(guī)避，阿貝描述的衍射極限。

可確定的分子物種的本地化與助染色的細(xì)胞器，如細(xì)胞骨架或膜。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），使得它可以觀察到在該樣本中沒有信號(hào)從外部的焦平面的區(qū)域，并允許光學(xué)切片。全內(nèi)反射顯微鏡（TIRF）是一種技術(shù)，它允許接近到細(xì)胞表面的薄區(qū)域的觀察。在這方面的一個(gè)漸逝場(chǎng)激發(fā)的熒光染料。

觀察一個(gè)分子物種的動(dòng)態(tài)變化的一種技術(shù)是熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）。在一個(gè)受限制的區(qū)域的熒光染料的光漂白和未漂白的分子的擴(kuò)散，進(jìn)入此區(qū)域可以測(cè)量。熒光能量轉(zhuǎn)移（FRET）的顯微鏡，可以進(jìn)行交互研究。一個(gè)興奮的捐助生色團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移到受體熒光激發(fā)它。如果兩者都匯集了非常密切的，這是*可能。如果這些染料被耦合到不同的蛋白質(zhì)，它們只能夠傳遞能量，發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，如果彼此交互。  

技術(shù)，使受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡，地面狀態(tài)消耗（GSD）顯微鏡，單分子和基態(tài)耗盡顯微鏡由單個(gè)分子的回報(bào)（GSDIM），光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)子高分辨率圖像光學(xué)重建顯微鏡（STORM）。子顯微鏡用于這些技術(shù)也被稱為作為nanoscopes，因?yàn)樗麄兘鉀Q在納米尺度的圖像。

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圖 5：Pukinje的細(xì)胞，矢狀節(jié)三重標(biāo)記小鼠小腦皮質(zhì)。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色環(huán)保：，藍(lán)色anti-GFAP/Cy5：赫斯特33258

 

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圖 6：鼠標(biāo)組織切片，自發(fā)熒光，熒光壽命microcsopy（FLIM）