尼康顯微鏡：CCD成像基本原理

顯微攝影的主要媒介，在過去的50年里，一直是電影，曾在科學(xué)界以及無數(shù)忠實(shí)地再現(xiàn)圖像從光學(xué)顯微鏡。它只有在過去十年中，在電子相機(jī)和電腦技術(shù)的改進(jìn)已經(jīng)使數(shù)字成像更便宜和更容易使用，比傳統(tǒng)攝影。

在圖1所示的是一個(gè)尼康Eclipse 600傳輸/反射光顯微鏡配備售后市場的珀耳帖冷卻的數(shù)碼相機(jī)能夠在一個(gè)較長的累積期間整合圖像。的照相機(jī)系統(tǒng)的控制由一個(gè)單獨(dú)的單元，其容納在一個(gè)IBM兼容個(gè)人計(jì)算機(jī)的FireWire端口的接口。整合期間和其他圖像采集參數(shù)選擇由專用的基于Windows的軟件程序。

當(dāng)相機(jī)具有電荷耦合器件（CCD）成像傳感器集成在傳感器上或非常接近的模擬至數(shù)字（A / D）轉(zhuǎn)換器，它一般被稱為作為數(shù)碼相機(jī)。由于CCD芯片，像所有的光學(xué)傳感器，模擬設(shè)備產(chǎn)生的電壓不同的流，數(shù)字一詞僅用于當(dāng)那些在計(jì)算機(jī)兼容格式在相機(jī)和輸出電壓進(jìn)行數(shù)字化處理。在一個(gè)12位的數(shù)碼相機(jī)中，從CCD的模擬信號被數(shù)字化，由板上的A / D轉(zhuǎn)換器具有12位深度。與否的輸出實(shí)際上可以被分解為4096個(gè)離散的強(qiáng)度水平（12位）取決于相機(jī)上的噪聲。為了區(qū)分個(gè)人之間的強(qiáng)度等級，每個(gè)灰度級的步驟應(yīng)該是大于約2.7倍的相機(jī)噪聲。否則，步驟2982和2983之間的差異，例如，不能得到解決的任何程度的確定性。一些所謂的12位相機(jī)有這么多的相機(jī)噪音不能受到歧視，4096個(gè)離散的步驟。

如果開始的是模擬信號，數(shù)字化過程中的相機(jī)，而不是下游某處為什么？使用相機(jī)的A / D轉(zhuǎn)換器有兩個(gè)好處：減少噪音和計(jì)算機(jī)兼容直接輸出。一般情況下，越接近A / D轉(zhuǎn)換是到傳感器時(shí)，噪聲電平越低。從CCD的低層次的模擬信號噪聲比他們高層次的數(shù)字更為容易損壞。在理想情況下，在A / D是CCD芯片上，緊鄰的傳感器的輸出放大器。噪聲越低，更多的灰度級可以被識別，因此，可以被有效用于強(qiáng)度測量的位數(shù)越多。

數(shù)碼相機(jī)的模擬對應(yīng)的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。數(shù)碼相機(jī)產(chǎn)生不同于攝像機(jī)的隔行掃描信號生成逐行掃描輸出。需要專門的隔行掃描視頻信號的數(shù)字化采集板和幀緩沖區(qū)。逐行掃描攝像機(jī)的輸出可以直接連接到計(jì)算機(jī)（例如，IEEE-1394，RS-422或SCSI接口）。在逐行掃描相機(jī)，整個(gè)圖像的曝光時(shí)間（也表示為整合期）期間首次收購，然后讀出，線線從頂部底部的圖像?，F(xiàn)代高速放大器和A / D轉(zhuǎn)換器，允許數(shù)碼相機(jī)全幀圖像的速度等于或超過視頻幀速率。

數(shù)碼相機(jī)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，輸出完全適合在計(jì)算機(jī)顯示器的格式。由于信號已經(jīng)數(shù)字化，圖像存儲，處理和顯示，大大簡化了類似的演習(xí)相比，使用視頻信號。數(shù)碼攝影照片，幻燈片和底片的處理中被淘汰的困難，因?yàn)楝F(xiàn)在許多科學(xué)期刊接受的數(shù)字圖像文件。其結(jié)果是提高質(zhì)量公布的圖像中顯示的演示。數(shù)字化圖像處理，壓縮，通過網(wǎng)絡(luò)傳播，粘貼到文檔中，或調(diào)整成一張海報(bào)。

CCD架構(gòu)

兩個(gè)CCD數(shù)碼相機(jī)設(shè)計(jì)中常用的隔行傳輸和幀傳輸。的行間傳輸CCD采用電荷轉(zhuǎn)移通道，每個(gè)光電二極管的旁邊，使得所累積的電荷可以是有效地和快速地交給他們的移位器（圖2）。隔行傳輸傳感器也可以被電子關(guān)門傾倒所存儲的電荷，而不是轉(zhuǎn)移到傳輸信道由“關(guān)”。幀轉(zhuǎn)移CCD采用由兩部分組成的傳感器，其中的上半部分是由一個(gè)不透光的掩膜覆蓋，并用作存儲區(qū)域。光被允許落在露天部分，所積累的電荷，然后迅速移入標(biāo)記的存儲區(qū)域。而信號的受光部的傳感器被集成時(shí)，所存儲的電荷被讀出。

科學(xué)應(yīng)用的波長選擇過濾器或傳感器的攝像頭單CCD攝像頭，用于兩種類型的數(shù)碼相機(jī)的色彩。兩者都使用過濾器來產(chǎn)生紅色，綠色和藍(lán)色的版本的字段的視圖。單傳感器攝像機(jī)使用一個(gè)濾光輪或液晶可調(diào)諧濾波器，獲得紅色，綠色和藍(lán)色的圖像順序的。三個(gè)傳感器的相機(jī)有一個(gè)分光棱鏡和修剪過濾器，使每個(gè)傳感器圖像適當(dāng)?shù)念伾⑼瑫r(shí)獲得所有三個(gè)圖像。不變的是，彩色攝像機(jī)的比單色因?yàn)榧臃质筒ㄩL選擇元件較不敏感。在某些應(yīng)用中，特別是免疫能力或快速連續(xù)同時(shí)捕捉多個(gè)波長的靈敏度的損失所抵消。此外，一些彩色攝像機(jī)達(dá)到一個(gè)更高的分辨率，通過對角抵消了紅色，綠色和藍(lán)色的傳感器，每個(gè)傳感器的像素的三分之一，從而增加兩倍獲得的樣本的數(shù)目。

雖然CCD攝像機(jī)的制造商和用戶經(jīng)常是指每個(gè)光電二極管的像素（圖像元素），就沒有必要的傳感器和在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器或打印機(jī)中的像素的數(shù)量和位置之間的對應(yīng)關(guān)系。然而，顯示器或打印機(jī)的分辨率應(yīng)至少高達(dá)傳感器。

量子效率

量子效率（QE）是指，被檢測到的入射光子數(shù)的百分比。（為便于參考，我們的明視覺的QE是3％左右;圖3）。硅光電二極管，CCD的基本構(gòu)造塊的，具有較高的量子效率（80％）在廣泛的范圍的可見光譜和近紅外到，如在圖3中示出。的CCD的分光靈敏度低于一個(gè)簡單的硅光電二極管，因?yàn)?/span>CCD電荷轉(zhuǎn)移通道在其表面上，可以降低峰值量子效率為約40％。

最近，一些科學(xué)級CCD的渠道的透明度已增加，量化寬松政策在藍(lán)綠色的范圍提高到近70％。從表面通道的損失完全消除在背照式CCD。在本設(shè)計(jì)中，光落到后面的CCD的區(qū)域中，已經(jīng)通過蝕刻減薄，直到它是透明的?？蓪?shí)現(xiàn)高達(dá)90％的量子效率。然而，早變薄的結(jié)果是，至今為止，只采用科學(xué)級，慢掃描CCD相機(jī)在一個(gè)微妙的，相對昂貴的傳感器。

在CCD相機(jī)的噪聲

有兩個(gè)主要的噪聲源在CCD相機(jī)的暗噪聲和讀出噪聲。雖然已取得了很大的改進(jìn)在過去的幾年里，在室溫下在減少CCD暗噪聲，冷卻芯片進(jìn)一步降低了噪音每20℃下降了十倍。黑暗的噪音是最明顯的，因?yàn)?/span>“熱”在積分周期為4或5秒后，與室溫CCD相機(jī)獲得的圖像的像素（白點(diǎn)）。冷卻至0℃，通常是足夠的積分周期長達(dá)30秒。需要很長的風(fēng)險(xiǎn)（例如，化學(xué)發(fā)光法）的實(shí)驗(yàn)需要傳感器的溫度更低。數(shù)碼相機(jī)提供在非制冷或制冷版本。

噪聲源不同，數(shù)碼相機(jī)，以及幾種常見的類型為示波器圖4中的痕跡。光子噪聲，暗電流，固定模式噪聲，和光響應(yīng)不均勻性所產(chǎn)生的CCD的本身，而復(fù)位噪聲，I / f噪聲和量化噪聲的數(shù)字輸出的模擬信號的放大和轉(zhuǎn)換過程中發(fā)生。CCD芯片上，每個(gè)光電二極管所存儲的電荷（即，像素）轉(zhuǎn)換成要量化的A / D轉(zhuǎn)換的模擬電壓的放大器中產(chǎn)生的讀出噪聲。讀出噪聲可以被看作是“收費(fèi)”，用于讀取所存儲的電荷必須支付。如果此收費(fèi)已穩(wěn)步下降5-10電子/像素由于在CCD設(shè)計(jì)的改進(jìn)，在過去的幾年中，時(shí)鐘和抽樣方法的大小。讀出噪聲讀出速度成比例地增加。去的成本，更快的更多的噪聲，因此，更多的不確定性中的電壓確定較低分辨率的位數(shù)號碼。這就是為什么慢掃描攝像機(jī)通常具有較低的讀出噪聲比更快的輸出檢測器，并具有較高的有用比特?cái)?shù)。數(shù)字came4ras范圍從8-12位深度為30幀每秒輸出16位深度在1-2幀每秒。

要的速度/讀出噪聲問題的解決方案之一是在一個(gè)大的CCD使用多個(gè)輸出放大器（抽頭）。而不是讀取所存儲的電荷，從整個(gè)CCD通過一個(gè)輸出放大器，該傳感器被分為4個(gè)或8個(gè)部分，每個(gè)都具有其自己的放大器。圖像讀出部分，然后縫合在一起，在軟件中的每秒數(shù)幀的速率。每個(gè)放大器所需的速度和相關(guān)的噪音也相應(yīng)降低。

信號噪聲比

由于光子隨機(jī)到達(dá)傳感器表面，它們的數(shù)量波動(dòng)與泊松統(tǒng)計(jì)檢測到的光子數(shù)的平方根等于所描述的噪聲。當(dāng)然，相機(jī)噪音將這個(gè)光子的統(tǒng)計(jì)噪聲，進(jìn)一步降低S / N。最高的S / N，可以通過一臺數(shù)碼相機(jī)的最大累積電荷（全井容量）的平方根。一個(gè)簡單的估計(jì)點(diǎn)的任何圖像的同質(zhì)區(qū)域的S / N是該地區(qū)的平均強(qiáng)度除以該地區(qū)的強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的利息。

多少像素的數(shù)碼相機(jī)已經(jīng)足夠？

的分辨率的CCD光電二極管和它們的大小相對于投影的圖像的數(shù)量的函數(shù)?，F(xiàn)在已是司空見慣的數(shù)碼相機(jī)CCD 1000×1000的光電二極管陣列。消費(fèi)者和科學(xué)級CCD制造的趨勢是減少，傳感器尺寸為4 x 4微米小一些CCD光電二極管。從采樣理論，只能達(dá)到足夠的分辨率的一個(gè)對象，如果至少有兩個(gè)樣本為每一個(gè)解析的單元。（許多用戶喜歡三個(gè)樣品每解析單位，以確保有足夠的采樣）。

最大分辨率像素的大小要求
在光學(xué)顯微鏡

表1

在落射熒光顯微鏡，阿貝1.4的數(shù)值孔徑鏡頭在550納米的衍射極限是0.22微米。100倍的物鏡，受衍射限制的點(diǎn)上的CCD面對投影大小為22微米。只是讓一個(gè)光電二極管尺寸為11×11微米的光學(xué)和電子的分辨率要匹配，一個(gè)7×7微米光電二極管的首選。在光學(xué)顯微鏡的最大分辨率像素大小的要求列在表1中的4倍到100倍的物鏡放大倍率范圍。100倍的物鏡并沒有額外的放大倍率7×7微米的光電二極管，1000×1000 CCD捕獲70×70微米的物體平面的一個(gè)字段的視圖。當(dāng)適當(dāng)?shù)牟蓸舆m當(dāng)?shù)卣{(diào)整大小的圖像投射到CCCD，更大數(shù)量的CCD中的光電二極管，而不是增加該字段的視圖的分辨率。各種輸出設(shè)備的分辨率的要求，可能需要在傳感器的過采樣，使最終的產(chǎn)品（例如，幻燈片，打印或海報(bào)）有足夠的分辨率的最終尺寸。

動(dòng)態(tài)范圍

intrascene動(dòng)態(tài)范圍表示的強(qiáng)度的有用的范圍內(nèi)，可同時(shí)檢測到相同的字段的視圖。interscene的是動(dòng)態(tài)范圍的強(qiáng)度的范圍內(nèi)時(shí)，可以容納不同的視場的檢測器增益，積分時(shí)間，鏡頭的光圈或其他變量作相應(yīng)調(diào)整。雖然小的CCD傳感器上從分辨率的角度來看是可取的，它們限制了動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的設(shè)備。的CCD的全阱容量是約1000倍，每個(gè)光電二極管的橫截面面積。因此，7 X7微米像素的CCD全阱容量49000電子或空穴。（甲孔的區(qū)域的硅從該電子來構(gòu)成和檢測到的光子的同樣有效的，可以使用的措施。使用的術(shù)語電子，雖然大多數(shù)的CCD讀出產(chǎn)生的空穴而不是電子的數(shù)量。）由于CCD的不具有固有的增益，一個(gè)電子 - 空穴對的每個(gè)檢測到的光子的累積。

通常被定義為全井容量除以由相機(jī)噪聲的CCD的動(dòng)態(tài)范圍。黑暗中，讀出噪聲的總和的平方和的平方根計(jì)算的相機(jī)噪聲。因此，一個(gè)49000電子全井產(chǎn)能的CCD讀出噪聲和暗噪聲可以忽略不計(jì)的10個(gè)電子的動(dòng)態(tài)范圍大約是4900，對應(yīng)于12位。但是，數(shù)字化，如果這樣的相機(jī)的輸出在12位深度意味著，49000電子分為4096 A / D轉(zhuǎn)換單元，每個(gè)包含12個(gè)電子（四千○九十六分之四萬九）。由于噪聲是10個(gè)電子，每個(gè)灰度級的步驟僅是1.2倍的噪音和不能夠被辨別。在10位的數(shù)字化會導(dǎo)致在每個(gè)A / D單元49的電子，約5倍的噪聲電平，并在1024個(gè)灰度級中的每一個(gè)然后可以判別。一個(gè)制表位深度的灰度層次和動(dòng)態(tài)范圍（分貝）表2所示，它涵蓋了一系列有五個(gè)量級。

控制速度，有效像素尺寸和實(shí)地查看

慢掃描的數(shù)碼相機(jī)允許的控制所讀出的速率，在像素的有效大小，構(gòu)成一個(gè)傳感器和該字段的視圖?？茖W(xué)級CCD相機(jī)通常提供兩個(gè)或兩個(gè)以上的讀出率，所以，速度可抵銷噪音交易。一個(gè)像素的有效尺寸，在許多慢掃描數(shù)碼相機(jī)可以增加分箱，一種方法，其中從集群中的相鄰光電二極管的電荷匯集和處理，如果是來自一個(gè)更大的探測器。

電荷耦合器件的動(dòng)態(tài)范圍

表2

分級是有用的，當(dāng)光線水平非常低，幾個(gè)光子的檢測，因?yàn)樗寡芯空呓灰卓臻g分辨率靈敏度。此外，最慢掃描CCD相機(jī)允許的感興趣區(qū)域讀出選定的圖像部分中，可以顯示和所積累的電荷的其余部分被丟棄。的劃分率一般增加成比例地減少領(lǐng)域的視圖。例如，有傳感器的CCD大小為1000×1000 10幀/ s，可以產(chǎn)生100幀/秒，如果所讀出的區(qū)域被減少到100×100二極管的輸出速率。通過交易過場的視圖和幀速率，研究者可以調(diào)整到一個(gè)更廣泛的范圍內(nèi)試驗(yàn)的情況下，將有可能比具有固定的幀速率攝像機(jī)。

強(qiáng)化數(shù)碼相機(jī)

現(xiàn)在，一些制造商提供數(shù)碼相機(jī)配備了非常低的微光成像圖像增強(qiáng)。這些具有接近的光電陰極，微通道板電子倍增器和磷光發(fā)光性的輸出畫面（參見圖5中的插圖）。在這些設(shè)備的最新一代的光電面具有較高的量子效率（高達(dá)50％），在藍(lán)綠色端的頻譜。放大器的增益是在很寬的范圍內(nèi)具有典型的最大為約80000的調(diào)節(jié)。從光電面以及從微通道板作為電子倍增噪聲降低熱噪聲的S / N在一個(gè)增強(qiáng)型CCD相機(jī)下面是一個(gè)緩慢的掃描CCD。強(qiáng)化CCD的分辨率取決于增壓器和CCD的，但通常是有限的增強(qiáng)微通道板幾何至75％左右，單獨(dú)的CCD。

愈演愈烈的數(shù)碼相機(jī)有一個(gè)的降低動(dòng)態(tài)（和intrascene動(dòng)態(tài)）范圍比較慢掃描相機(jī)，而且大多數(shù)是有限的10位分辨率。放大器增益可以快速和可重復(fù)地改變，以適應(yīng)場景亮度的變化，從而增加在interscene動(dòng)態(tài)范圍。

事實(shí)上，由于圖像增強(qiáng)可門，也就是說，關(guān)閉或在幾納秒，相對明亮的物體，可以可視化的“開”的時(shí)間減少。門控，強(qiáng)化數(shù)碼相機(jī)最需要的時(shí)間分辨熒光顯微鏡的應(yīng)用，因?yàn)樘綔y器調(diào)制高頻增益必須在光源同步。由于活細(xì)胞所需的低光照通量，增強(qiáng)型CCD相機(jī)經(jīng)常研究動(dòng)態(tài)事件和比率成像。

選擇適當(dāng)?shù)南鄼C(jī)

沒有任何單一的檢測，在熒光顯微鏡將滿足所有要求，所以的研究者必須妥協(xié)。曝光時(shí)間往往是最重要的參數(shù)。當(dāng)時(shí)間是形象整合，慢掃描CCD相機(jī)的表現(xiàn)將優(yōu)于強(qiáng)化相機(jī)在各個(gè)領(lǐng)域，在很大程度上是因?yàn)槠涓叩牧孔有屎透偷脑胍?。冷卻總是提高數(shù)碼相機(jī)的性能，但差異可能并不明顯，當(dāng)積分時(shí)間為幾秒或更少的數(shù)字化深度為8-12位。對于涉及數(shù)字反卷積的應(yīng)用中，檢測器的選擇是水冷，科學(xué)級，慢掃描的攝像頭，能夠產(chǎn)生一個(gè)高分辨率的，14-16-位的圖像。光電二極管的尺寸事項(xiàng);一些CCD具有這么小的像素，可能不得不被限制，以避免飽和的電荷存儲阱，結(jié)果可能會受到影響的動(dòng)態(tài)范圍和峰值的S / N的積分周期。如果被調(diào)查事件是快速的，但可以精確地觸發(fā)，然后緩慢掃描CCD工作在突發(fā)模式或高速模式可能是合適的。然而，當(dāng)該事件是不容易預(yù)測，試樣必須在低入射光通量連續(xù)監(jiān)測，增強(qiáng)型CCD檢測器給出。出于這個(gè)原因，單分子熒光成像使用加強(qiáng)的數(shù)碼相機(jī)。

的顯微照片，圖6給出了三重染色與一些熒光發(fā)色團(tuán)的薄邊的小鼠小腸是一個(gè)組合epi-fluorescence/phase的對比度的圖像。一個(gè)尼康的Eclipse E600，類似于一個(gè)如圖1所示，利用與尼康DXM 1200數(shù)碼相機(jī)記錄的圖像，如圖6。當(dāng)彩色圖像所需的常規(guī)的組織學(xué)標(biāo)本三個(gè)CCD攝像機(jī)是優(yōu)選的一個(gè)不可分割的顏色掩模廉價(jià)的單傳感器的攝像頭。高分辨率，單傳感器CCD攝像頭，配備了一個(gè)可拆卸的，紅，綠，藍(lán)，液晶濾波器已被證明是非常有用的明場和熒光顯微鏡。

前景

最近的CMOS（互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體）攝像頭預(yù)示著一個(gè)潛在的未來的重要作用，這些設(shè)備在熒光顯微鏡的性能改善。CMOS攝像頭在一個(gè)集成芯片上的格式的每個(gè)光電二極管與一個(gè)放大器和數(shù)字化。其結(jié)果是成本低，結(jié)構(gòu)緊湊，通用的檢測器的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合的硅檢測沒有問題的電荷轉(zhuǎn)移。CMOS傳感器允許再次操縱單個(gè)光電二極管，感興趣區(qū)域的讀出，高速采樣，電子快門和曝光格式的計(jì)算機(jī)界面。直到最近，他們遭受高的固定模式噪聲相關(guān)的開關(guān)和采樣文物，但現(xiàn)在正在迅速解決這些問題。它是可能的，他們將替換為在不久的將來的科學(xué)應(yīng)用在數(shù)碼相機(jī)的CCD。