尼康顯微鏡：維持活細(xì)胞顯微鏡載物臺(tái)上

越來(lái)越多的調(diào)查，使用活細(xì)胞成像技術(shù)的基本性質(zhì)，細(xì)胞和組織的功能，特別是由于目前正在目睹熒光蛋白合成熒光技術(shù)的快速進(jìn)步提供重要的洞察。由于這些進(jìn)步，活細(xì)胞成像已經(jīng)成為必要的分析工具，在大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，以及一個(gè)常規(guī)的方法，在廣泛領(lǐng)域的神經(jīng)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，藥理學(xué)，和許多其他相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究的學(xué)科實(shí)line。其中最重要的技術(shù)挑戰(zhàn)進(jìn)line成功的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞維持在一個(gè)健康的狀態(tài)，并合成熒光和/或熒光蛋白的存在而被照亮顯微鏡舞臺(tái)上正常工作。

環(huán)境的嚴(yán)密的控制是一個(gè)成功活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中的最重要的因素。特別是，在何種條件下細(xì)胞的顯微鏡載物臺(tái)保持，雖然在許多要求，這取決于生物體廣泛變量，往往決定了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功或失敗的。容易地操縱包括環(huán)境方面的腔室中，細(xì)胞的生長(zhǎng)和成像的物理參數(shù)，溫度控制的本地化程度，大氣條件（氣體混合物和濕度），營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的緩沖液（pH），培養(yǎng)基的滲透壓。

圖1中所示的一系列的捕獲的圖像從幾個(gè)不相關(guān)的細(xì)胞系，每個(gè)標(biāo)記的合成的熒光基團(tuán)和/或熒光蛋白的不同組合。兔腎上皮細(xì)胞（RK-13 line），在圖1（a）與增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）和核靶向信號(hào)肽，在細(xì)胞核中定位一種黃綠色的標(biāo)簽的融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。隨后用MitoTracker Red CMXRos的細(xì)胞染色的線粒體。在圖1（b）中，負(fù)鼠腎近端小管上皮細(xì)胞（OK）轉(zhuǎn)染EYFP-actin蛋白的亞細(xì)胞定位載體標(biāo)記的絲狀肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)。線粒體有針對(duì)性與DsRed2在圖1（c）在印度麂細(xì)胞融合載體，，而EGFP-peroxisomal的嵌合質(zhì)粒亮點(diǎn)過(guò)氧化物酶在人宮頸癌細(xì)胞（HeLa line）在圖1（d）。正常的金色敘利亞倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞（BHK-21line）的貼壁培養(yǎng)的精選圖1（e）DsRed2 FP-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和EGFP-細(xì)胞核亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)染的混合物，從而本地化綠色熒光蛋白標(biāo)簽細(xì)胞核和橙紅色的探針的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。最后，人骨骨肉瘤細(xì)胞（U2OS line），圖1（g）中示出的轉(zhuǎn)染與天藍(lán)熒光蛋白融合到線粒體靶序列標(biāo)簽線粒體。對(duì)于圖1中的每一個(gè)圖像，一個(gè)單獨(dú)的信道被記錄，可使用微分干涉對(duì)比，并且重疊的熒光通道（s），以確定小區(qū)邊界和其他的共同的結(jié)構(gòu)特征，如細(xì) 胞核。

在制定計(jì)劃的過(guò)程中，為活細(xì)胞的觀察和長(zhǎng)期的成像實(shí)驗(yàn)，是值得認(rèn)真考慮的一些重要因素。試樣應(yīng)準(zhǔn)確地標(biāo)記的熒光團(tuán)的熒光蛋白質(zhì)或合成的（次）還，以便清楚地可視化的物鏡生物成分。也許更重要的是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，必須保持在一個(gè)條件，促進(jìn)生長(zhǎng)和正常功能，以避免潛在的工件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋中。此外，細(xì)胞應(yīng)成像的方式，不會(huì)誘發(fā)光毒性或擾動(dòng)定位的熒光探針具有足夠的空間和時(shí)間分辨率。其中最重要的活細(xì)胞成像，必須加以解決（在下面詳細(xì)討論;見(jiàn)表1）常規(guī)考慮溫度，氧，濕度，滲透壓，pH值（中小型緩沖），光毒性，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，顯微鏡焦點(diǎn)漂移，流血通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度，和分辨率。

維持活細(xì)胞顯微鏡舞臺(tái)上處于健康狀態(tài)的任何活細(xì)胞成像調(diào)查無(wú)疑是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，一般需要結(jié)合機(jī)械別出心裁，伴隨著敏銳的洞察正在研究細(xì)胞或組織的生物學(xué)。雖然許多實(shí)驗(yàn)室擅長(zhǎng)于生長(zhǎng)溫度控制二氧化碳孵化器中培養(yǎng)的細(xì)胞，維持長(zhǎng)期成像實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞在顯微鏡載物臺(tái)的任務(wù)更為苛刻。成像室必須保持正常運(yùn)作的持續(xù)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞（或組織），同時(shí)允許通過(guò)顯微鏡的物鏡的不受限制的訪問(wèn)權(quán)限。高數(shù)值孔徑的油或水浸泡物鏡正在使用時(shí)，會(huì)變得特別困難的這一壯舉。在許多情況下，調(diào)查員必須能夠引進(jìn)的試劑，而成像（擾亂一個(gè)特定的細(xì)胞的過(guò)程，而不會(huì)干擾時(shí)間推移序列轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)或舞臺(tái)上的地位，。其他重要的因素是簡(jiǎn)單，可靠性和合理的成本。下面的討論中主要集中于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，但其他生物的各種技術(shù)之間的輕微差異，通常是不嚴(yán)格的。例如，酵母，昆蟲(chóng)，和植物細(xì)胞的培養(yǎng)物沒(méi)有嚴(yán)格的溫度要求，介質(zhì)組合物，而不是細(xì)菌細(xì)胞的要求。

培養(yǎng)介質(zhì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系

盡管媒體在細(xì)胞和組織培養(yǎng)的早期嘗試的混合物，含有胚胎提取物，血清，的蛋白質(zhì)hydrosylates和主機(jī)其他體液傳播，迅速 過(guò)渡到生化要求的基礎(chǔ)上定義的媒體建立。其中，最流line的是鷹的基礎(chǔ)（EBM）和最小基本（MEM）文化傳媒，貝科的修改MEM（DMEM），火腿的媒體（F-10和F-12），和2高度精煉的媒體配方設(shè)計(jì)在羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所（RPMI 1640和RPMI 199）的。此外，設(shè)計(jì)的碳酸氫鹽緩沖液的情況下（和二氧化碳）中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，Leibovitz的L-15，已被廣泛采用。所有這些培養(yǎng)基都需要添加血清（通常來(lái)自于胎兒和新生兒的牛犢或馬），至終體積分?jǐn)?shù)5％和20％之間不等。嚴(yán)格定義的條件下，在生物制藥line業(yè)中的應(yīng)用受益，也已發(fā)展為高度專業(yè)化的培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。許多實(shí)驗(yàn)室在培養(yǎng)涉及各種各樣的細(xì)胞類型往往危及一個(gè)確切的配方的嚴(yán)格要求使用一個(gè)復(fù)雜的介質(zhì)，如火腿的F-12的混合物，與一第二介質(zhì)（DMEM培養(yǎng)液，例如）含有較高的氨基酸酸和維生素的濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物，差別很大，但大多數(shù)配方包括氨基酸，維生素，無(wú)機(jī)鹽（礦物質(zhì)），微量元素，核酸成分（基地和核苷），糖，酶，脂類，三羧酸循環(huán)的中間體，各種其他生化。簡(jiǎn)單的媒體，如MEM，含有必需氨基酸的氨基酸，維生素，和它的鹽，而更復(fù)雜的配方（RPMI及無(wú)血清培養(yǎng)基）有數(shù)百個(gè)組件。細(xì)胞培養(yǎng)基通常是為特定目的而設(shè)計(jì)的，包括常規(guī)增長(zhǎng)的正常永生（轉(zhuǎn)化）的細(xì)胞株，小學(xué)文化的萌生，病毒傳播，藥物制劑，并定義遺傳變異的生長(zhǎng)條件。在所有組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方的控制變量之間的pH值，緩沖容量，氧濃度，滲透壓，粘度，表面張力。當(dāng)細(xì)胞在顯微鏡成像，即使是很短的時(shí)間，這些相同的培養(yǎng)基條件下，必須仔細(xì)地再現(xiàn)中的活細(xì)胞成像系統(tǒng)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的環(huán)境變量

表1

大多數(shù)流line的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞株生長(zhǎng)非常好，在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)的pH值在7.2和7.4之間，但一些正常的成纖維細(xì)胞pH值略高（7.7）有更好的表現(xiàn)，而許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞系成長(zhǎng)得更快更多的酸性介質(zhì)中（pH值至7.0）。在pH值的情況下，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，電鍍效率測(cè)定應(yīng)在物鏡pH值，以確保在選定的單元格線將及格。大多數(shù)市售培養(yǎng)基配方中含有近似的視覺(jué)測(cè)定pH值的指示劑（酚紅）。在溶液中，酚紅產(chǎn)生一個(gè)明亮的紅******調(diào)，在pH值為7.4，在pH值為7.0，變?yōu)槌壬忘S色，在pH 6.5，顏色的轉(zhuǎn)變，往往是當(dāng)介質(zhì)變得更加酸性文化形成融合單層。在較高的pH值，在pH 7.6，酚紅是粉紅色的紫色，在pH 7.8和以上。許多組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)它很有用在平衡鹽溶液在不同pH值的比較文化傳媒建構(gòu)一套使用酚紅的pH值標(biāo)準(zhǔn)。指示劑染料雖然是必不可少的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，由于高的可見(jiàn)光吸收的消光系數(shù)，它的使用應(yīng)避免在活細(xì)胞熒光成像的實(shí)驗(yàn)，以減少背景噪聲的電平，以防止光毒性。認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)，廠家提供的最常見(jiàn)的培養(yǎng)基配方在無(wú)菌液體或粉末狀無(wú)酚紅。

幾乎所有細(xì)胞系都要求二氧化碳和碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)pH值，并且必須要嚴(yán)格控制濃度二氧化碳的一小部分（通常為5％至7％，根據(jù)碳酸氫鹽濃度）的氣氛中，在專門(mén)的孵化器中培養(yǎng)溶解的氣體。對(duì)于活細(xì)胞成像顯微鏡，可以產(chǎn)生一個(gè)合適的氣氛與二氧化碳困難和通常需要培養(yǎng)室是專為受規(guī)管的氣氛。的引入，如合成生物緩沖劑的TRIS，HEPES，可疑的值已經(jīng)在消除二氧化碳的要求，盡可能多的細(xì)胞株，因此無(wú)法容忍的二氧化碳缺乏，特別是在低細(xì)胞濃度。在一般情況下，10?20毫摩爾HEPES緩沖液的濃度可以控制pH值在生理范圍內(nèi)的情況下，在二氧化碳?xì)夥罩?，但培養(yǎng)基中仍然應(yīng)該補(bǔ)充最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)，用碳酸氫鈉。

嘗試增長(zhǎng)細(xì)胞顯微鏡單獨(dú)使用HEPES通常會(huì)導(dǎo)致大幅降低增長(zhǎng)率（尤其是長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)），并應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)細(xì)胞系的能力成長(zhǎng)和功能的媒體沒(méi)有二氧化碳緩沖系統(tǒng)。注意，補(bǔ)充HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)不僅降低了pH值漂移率，并且不消除將培養(yǎng)物暴露在大氣中時(shí)所發(fā)生的堿度逐步增加。此外，許多報(bào)告已經(jīng)浮出水面HEPES毒性在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，推測(cè)可能是由于增加自由基的形成可視化所需的熒光探針的照明條件下合成的緩沖區(qū)。Leibovitz的L-15培養(yǎng)基中，一個(gè)專門(mén)的配方，通過(guò)使用具有高氨基酸濃度的丙酮酸鈉和緩沖的目的是消除二氧化碳。包括在培養(yǎng)基中丙酮酸鈉使細(xì)胞增加內(nèi)源性產(chǎn)生的二氧化碳，理論上使它們獨(dú)立的氣體（如碳酸氫鈉）。然而，許多細(xì)胞系并沒(méi)有很好地適應(yīng)到L-15培養(yǎng)基，并配置基于這一提法的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)前應(yīng)徹底檢查幾個(gè)段落。

細(xì)胞系可以有很大的不同，雖然他們的氧氣需求正常大氣中的氧張力水平將滿足大多數(shù)文化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常需要氧氣呼吸在體內(nèi)，但往往可以成功地替代糖酵解（厭氧過(guò)程）時(shí)，生長(zhǎng)在培養(yǎng)容器作為主線路或之后永生。以上的細(xì)胞培養(yǎng)液中的深度可以影響生長(zhǎng)在玻璃或塑料的表面上的貼壁細(xì)胞的氧擴(kuò)散率，并應(yīng)保持低于5毫米。在大多數(shù)情況下，活細(xì)胞成像，嚴(yán)格氧調(diào)控是沒(méi)有必要的，相反，氧氣的消耗，經(jīng)常被用來(lái)作為一項(xiàng)戰(zhàn)略，以減少光損傷，可以通過(guò)與氧自由基反應(yīng)發(fā)生在熒光照明。然而，應(yīng)該指出的是，降低氧張力可以是一樣有害的細(xì)胞，如果他們開(kāi)始遭受低氧應(yīng)激。減少的氧含量的最常用的方法涉及的商業(yè)氧氣耗盡系統(tǒng)的應(yīng)用，如Oxyrase。替代技術(shù)來(lái)限制，由于分子氧自由基的損害，包括清除劑，如抗壞血酸（抗壞血酸維生素C），或Trolox（維生素E衍生物）的培養(yǎng)基中添加，但降低照明強(qiáng)度的策略，再加上高度敏感的攝像系統(tǒng)也應(yīng)考慮。

大多數(shù)流line的細(xì)胞株有一個(gè)相當(dāng)廣泛的公差滲透壓將增長(zhǎng)以及滲透壓260和320 milliosmolar之間。低滲介質(zhì)中的情況下，細(xì)胞常規(guī)生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿或開(kāi)放式平板培養(yǎng)，可以被取代的，以補(bǔ)償蒸發(fā)。有機(jī)緩沖劑或篩選質(zhì)粒的藥物，如HEPES和G-418，由另外的結(jié)構(gòu)改變時(shí)，重要的是監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的滲透壓。在活細(xì)胞成像中的離子和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分的濃度將最初的實(shí)驗(yàn)中選擇設(shè)置，但大多數(shù)成像室容納少量的媒體滲透壓的變化（這個(gè)問(wèn)題通常是由于蒸發(fā)嚴(yán)重，當(dāng)介質(zhì)被加熱到37攝氏度）。因此，必須特別注意裝配時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入室，改變培養(yǎng)基時(shí)，如果發(fā)生任何蒸發(fā)（細(xì)胞滲透壓的快速變化是非常敏感的）。此外，在成像實(shí)驗(yàn)，蒸發(fā)應(yīng)最小化，或者通過(guò)使用一個(gè)密封的系統(tǒng)，由覆蓋與油具有較低的密度比水（通常為礦物油中）的一個(gè)開(kāi)放的腔室中的介質(zhì)，或通過(guò)在成像過(guò)程中，加濕室。請(qǐng)注意，在一般情況中，微環(huán)境提供的一個(gè)活細(xì)胞成像腔室的體積小，在本質(zhì)上是不太穩(wěn)定的二氧化碳培養(yǎng)箱中的每一個(gè)細(xì)節(jié)需要相當(dāng)多的關(guān)注。

選擇活細(xì)胞成像細(xì)胞系

用于活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的選擇往往決定（有限）由多項(xiàng)因素，包括物鏡生物的調(diào)查觀測(cè)能力的細(xì)胞合成熒光，轉(zhuǎn)染效率，必須標(biāo)明一個(gè)特定的line的嚴(yán)格的培養(yǎng)室的環(huán)境和光照條件下的耐受性。過(guò)于頻繁，顯示優(yōu)異的性能，在一個(gè)或多個(gè)類別的細(xì)胞系進(jìn)line輕微或完全在另一個(gè)失敗。例如，正常牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（BPAE線）可以被固定和染色，在使用合成的熒光基團(tuán)揭示錯(cuò)綜復(fù)雜的蜂窩結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)與細(xì)膩清晰，但的線只能在效率低（少于5％的熒光蛋白載體轉(zhuǎn)染的）和相對(duì)不耐長(zhǎng)期在低光照水平，不影響許多其他細(xì)胞系的照明?；蛘?，兔腎上皮細(xì)胞（RK-13 line）可以用各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高效率十分寬容延伸的數(shù)天的時(shí)間推移序列期間的高照度水平（包括激光），但沒(méi)有得到充分沾上許多共同合成的熒光團(tuán)（如MitoTrackers）專為活細(xì)胞成像。

在成功的一個(gè)最重要的因素觀察活細(xì)胞的生物現(xiàn)象研究和成像選擇特定line必須顯示必要的形態(tài)和生理特性，以清楚地表明利益的概念。針對(duì)有絲分裂的研究，例如，許多細(xì)胞系不到足夠的成像，由于這樣的事實(shí)，分裂的細(xì)胞成為球形的，并可能從基材上分離。相反，在有絲分裂過(guò)程中保持相對(duì)平坦的，并連接到基板的細(xì)胞系是遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于在細(xì)胞分裂過(guò)程中揭示的有絲分裂紡錘體的細(xì)節(jié)。其中最有用的line進(jìn)line有絲分裂研究大鼠袋鼠腎細(xì)胞（PtK1 PTK2線，見(jiàn)表2），這只能在相對(duì) 低的轉(zhuǎn)染效率，但包含在顯微鏡更容易區(qū)分的染色體是一個(gè)小數(shù)目。其他幾個(gè)腎細(xì)胞系，其中包括從豬（LLC-PK1）和另一名來(lái)自非洲綠猴（BS-C-1 ）也仍然附著在有絲分裂過(guò)程中，更容易轉(zhuǎn)染。豬和猴細(xì)胞中含有較多的染色體比鼠袋鼠，但其易于轉(zhuǎn)染和成像使它們優(yōu)秀的替代品進(jìn)line調(diào)查的有絲分裂。細(xì)胞在細(xì)胞分裂過(guò)程中保持扁平的培養(yǎng)室的玻璃是有用的有絲分裂紡錘體的觀測(cè)，此外，也可以顯示其他細(xì)胞成分的分布，如高爾基體，細(xì)胞骨架元素，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。

活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系

表2

應(yīng)進(jìn)line調(diào)查的骨架與細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)和具體定位（s）表示，正在研究，表現(xiàn)出高水平的。絲狀肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維通常是更清楚地定義在成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞相比，但有許多例外。細(xì)胞角蛋白中間絲形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，很容易與可視化免疫熒光或熒光蛋白在一些上皮細(xì)胞株（雖然并不普遍）。不幸的是，細(xì)胞角蛋白網(wǎng)絡(luò)是不好界定或成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及許多品種幾乎不存在。同樣，波形蛋白，結(jié)蛋白，外周神經(jīng)絲蛋白，核纖層蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）中間絲形成突出的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)在多種細(xì)胞類型，但在別人難以察覺(jué)。在幾乎所有的情況下，靶line應(yīng)先固定，合成熒光基團(tuán)和/或抗體標(biāo)記在試圖本地化熒光蛋白活細(xì)胞成像前測(cè)試。

細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的動(dòng)態(tài)過(guò)程中的信息，在追求各種耦合熒光蛋白活細(xì)胞成像的應(yīng)用開(kāi)辟了許多新的途徑。先進(jìn)的熒光顯微鏡技術(shù)漂白后恢復(fù)（FRAP），共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），相關(guān)光譜（FCS），斑點(diǎn)顯微鏡（FSM）在其發(fā)展明顯受益，從使用的熒光蛋白。這些隨處可見(jiàn)的分子也被轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，可光活化的特異性地標(biāo)記的一個(gè)更大的分子群體的個(gè)別成員的新一代光學(xué)熒光筆。更進(jìn)了一步，福斯特共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，熒光蛋白偶聯(lián)已經(jīng)產(chǎn)生了一類新的生理生物傳感器探針是有用的報(bào)告各種離子，如鈣，鈉，鉀，氯離子，pH值，此外還有一個(gè)過(guò)多的細(xì)胞事件，包括酶的活性，膜電位變化，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，和氧化還原。所有這些強(qiáng)大的新技術(shù)的基礎(chǔ)是建立在活細(xì)胞表達(dá)的基因編碼的熒光探針成像。

列于表2是幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，一直到許多活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)在科學(xué)文獻(xiàn)中報(bào)道的重大服務(wù)的清單。研究人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）線是一個(gè)永生化上皮細(xì)胞已經(jīng)聚集了豐富的信息。這豐盛的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可以在高效率熒光蛋白載體，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，并定義本地化。轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞（COS-7線）已被用來(lái)研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而倉(cāng)鼠細(xì)胞系（BHK-21和CHO-K1）調(diào)查涉及的分子和細(xì)胞的最愛(ài)生物病毒，細(xì)胞內(nèi)酶的活性，受體，促進(jìn)功能和傳輸機(jī)制。表2中列出的其他細(xì)胞也響應(yīng)于轉(zhuǎn)染，微注射技術(shù)，合成熒光標(biāo)記與長(zhǎng)期在寬視場(chǎng)共焦熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)。

活細(xì)胞成像錢(qián)伯斯的簡(jiǎn)要概述

標(biāo)本室多年來(lái)描述系統(tǒng)，提供卓越的光學(xué)性能，同時(shí)允許不同時(shí)間量要保持標(biāo)本，顯微鏡和一些設(shè)計(jì)史上的一個(gè)不可或缺的分支已經(jīng)公布。短期成像實(shí)驗(yàn)中（20?30分鐘或更?。?，可以簡(jiǎn)單地進(jìn)line附加到載玻片含有貼壁細(xì)胞的蓋玻片，使用隔離物，以保持細(xì)胞的損壞（物理應(yīng)激可誘導(dǎo)某些細(xì)胞系中的自發(fā)熒光）。能夠確保蓋玻片與一些密封劑，包括熔化的瓊脂糖，橡皮泥，真空潤(rùn)滑脂，或一個(gè)有用的制劑稱為VALAP（凡士林，羊毛脂，石蠟的1:1:1的混合物）的任何一個(gè)，以提供水密密封和消除培養(yǎng)基中的蒸發(fā)。由硅橡膠（市售）或碎片的蓋玻片的切薄的墊片，可以用作隔離物，以保持細(xì)胞的顯微鏡載片上的直接接觸來(lái)。蓋玻片表面含有細(xì)胞正面朝下放置在隔板上，并填寫(xiě)蓋玻片和幻燈片之間的空隙用生理緩沖液（如磷酸鹽緩沖液PBS）。密封蓋玻片的邊緣周?chē)褂玫脑噭┑倪x擇和放置在顯微鏡載片上，在舞臺(tái)上成像。細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，溫度控制，將正常的只有幾分鐘，但是這往往是足夠的時(shí)間來(lái)獲得必要的圖。

對(duì)于較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，特別設(shè)計(jì)的環(huán)境試驗(yàn)箱提供一種機(jī)制，用于觀看和活細(xì)胞成像顯微鏡載物臺(tái)，以及培養(yǎng)保持長(zhǎng)時(shí)間的最適生長(zhǎng)條件非常接近。在一般情況下，成像的腔室包括一個(gè)玻璃窗口，通常的厚度的蓋玻片（約170微米），通過(guò)它的細(xì)胞，可以容易地工作在高數(shù)值孔徑的物鏡觀察。溫度控制，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞中，一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)往往是通過(guò)使用外圍紅外輻射或加熱后的空氣源（如吹風(fēng)機(jī)或溫?zé)犭u蛋的），直接耦合到腔室的熱敏電阻控制下的金屬加熱板，或用光學(xué)透明通過(guò)蒸發(fā)施加到蓋玻片的表面，以提供更有效的熱傳導(dǎo)到腔室的導(dǎo)電性金屬氧化物的薄涂層。

多種市售室可以購(gòu)買(mǎi)（或者，很容易在內(nèi)部構(gòu)造）活細(xì)胞成像通常分為兩個(gè)基本功能類別：開(kāi)放室，培養(yǎng)皿，進(jìn)入到大氣中，其中有自由;和封閉的腔室是密封的保護(hù)細(xì)胞的培養(yǎng)基中的蒸發(fā)。一個(gè)開(kāi)放的腔室系統(tǒng)通常會(huì)允許生長(zhǎng)的細(xì)胞的快速訪問(wèn)，從而很容易使顯微注射，添加藥物的培養(yǎng)基中，細(xì)胞或其他操作，改變。與此相反，封閉的腔室提供來(lái)自外部環(huán)境的保溫效果更好，但使進(jìn)入細(xì)胞更加困難。最封閉的室內(nèi)設(shè)計(jì)包括端口允許添加新鮮培養(yǎng)基和藥物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不中斷的成像序列。在這些系統(tǒng)中，灌注的調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵，馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的注射器，或通過(guò)重力控制歧管。新的解決方案，當(dāng)被添加到一個(gè)封閉的腔室，這是至關(guān)重要的，除了前平衡到相同的溫度，細(xì)胞。此外，許多細(xì)胞對(duì)剪切敏感的，所以應(yīng)該進(jìn)line灌注連接到蓋玻片的貼壁細(xì)胞在非常低的流速。一些更先進(jìn)的密閉腔系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供控制剪切力。

許多最簡(jiǎn)單的商業(yè)開(kāi)放室的成像系統(tǒng)的構(gòu)造，通過(guò)安裝到一個(gè)普通的組織培養(yǎng)皿或陪替氏培養(yǎng)皿底部的蓋玻片。標(biāo)準(zhǔn)35和60毫米的無(wú)菌培養(yǎng)皿中鉆一個(gè)小孔（直徑約一厘米）在盤(pán)170微米的塑料蓋玻片融合，使高分辨率成像。矩形蓋玻片和一個(gè)小的單個(gè)或多個(gè)孔塑料成像室密封玻璃的顯微鏡載片也有市售，但是相當(dāng)昂貴的。這些腔室的設(shè)計(jì)是比較簡(jiǎn)單的使用，但它們不是緊密地密封，這樣的培養(yǎng)基中，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中蒸發(fā)的量必須被仔細(xì)地監(jiān)測(cè)。另外，大多數(shù)的簡(jiǎn)單的成像腔室不包括任何加熱系統(tǒng)，必須安裝在顯微鏡載物臺(tái)配備有一個(gè)輔助的加熱單元，被專門(mén)設(shè)計(jì)用于容納腔室。沒(méi)有溫度控制，簡(jiǎn)單的開(kāi)放室系統(tǒng)性能是僅略微優(yōu)于使用密封蓋玻片上述方法。

FCS2 Bioptechs活細(xì)胞成像室在圖2（a）所示類似的密封封閉腔比最簡(jiǎn)單的開(kāi)放室系統(tǒng)更昂貴，但他們提供了更多的控制環(huán)境，對(duì)許多人來(lái)說(shuō)，并能保持細(xì)胞處于健康狀態(tài)小時(shí)（甚至數(shù)天或數(shù)周）。一個(gè)典型的封閉室系統(tǒng)提供了兩個(gè)光學(xué)表面分離灌注環(huán)密封墊片。這種三明治，然后用金屬或復(fù)合材料外殼，其目的是提供溫度控制和安全地適應(yīng)顯微鏡載物臺(tái)的夾緊在一起。有了這樣的外殼，灌注率，介質(zhì)體積，溫度，氣氛，流動(dòng)的幾何形狀，和光穩(wěn)定性成像室控制到相對(duì)高的程度相比，開(kāi)放系統(tǒng)室。先進(jìn)的密閉腔系統(tǒng)（圖2（a）條）降低流體的交換時(shí)間，提供流量控制的灌注介質(zhì)，以避免令人不安的貼壁細(xì)胞，提供卓越的溫度調(diào)節(jié)，并保持接近光學(xué)表面的觀察使用高數(shù)值光圈顯微鏡的物鏡。此外，用戶可以定義培養(yǎng)基在細(xì)胞表面的流動(dòng)條件，以滿足實(shí)驗(yàn)要求。各種各樣的封閉小室的活細(xì)胞成像系統(tǒng)可以買(mǎi)到。

巔峰活細(xì)胞成像室倒置顯微鏡，提供幾乎完全控制的環(huán)境下，其中的一個(gè)例子是在圖2（b）有效地結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)孵化器。孵化器的外殼是最常見(jiàn)的有機(jī)玻璃建造，圍繞顯微鏡階段，物鏡，熒光過(guò)濾器，并傳送聚光。在這些腔室可用于與各種培養(yǎng)皿或包括標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，配有蓋玻片的顯微鏡載玻片，上面所討論的，其他打開(kāi)和閉合系統(tǒng)和許多。與外部加熱單元（通常強(qiáng)制空氣）和二氧化碳的濃度來(lái)控制的感測(cè)單元，其耦合到一個(gè)穩(wěn)壓器，它的輸入由純氣體的氣缸的溫度被保持。這些單位也可配有濕度控制等多種設(shè)計(jì)方案，提供橡膠手套訪問(wèn)操縱細(xì)胞時(shí)，在成像過(guò)程中對(duì)環(huán)境的平衡，以避免干擾。為了維持高度的溫度控制，一些更復(fù)雜的孵化室括幾乎整個(gè)顯微鏡目鏡，攝像頭，lamphouses異常。在下line路上，環(huán)境試驗(yàn)箱可以阻礙快速訪問(wèn)標(biāo)本和繁瑣的重復(fù)操作時(shí)是必要的。此外，腔室內(nèi)部的高濕度水平可加至維持齒輪潤(rùn)滑油過(guò)早降解和氧化的金屬表面和透鏡涂料由于儀器費(fèi)用。大多數(shù)的顯微鏡制造商提供了一個(gè)自定義的孵化器選項(xiàng)倒置顯微鏡，而售后市場(chǎng)供應(yīng)商更簡(jiǎn)單，更先進(jìn)的機(jī)型填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白，以及許多有用的配件。

如上所討論的，廣泛的打開(kāi)和閉合的活細(xì)胞成像室設(shè)計(jì)是市售的，其中有許多是相當(dāng)適用于特定的應(yīng)用程序。這是值得探討的各種可供選擇的時(shí)候走上了漫長(zhǎng)的道路，成功的活細(xì)胞成像。多數(shù)研究者的青睞的技術(shù)，使用一個(gè)特定的系統(tǒng)，反映他們的經(jīng)驗(yàn)，而這些喜好跨越室設(shè)計(jì)的色域。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道，有幾個(gè)功能的系統(tǒng)與現(xiàn)成的上門(mén)維修絕緣薄片，膠帶，和廉價(jià)的加濕器使用干衣機(jī)的排氣管連接到所述腔室的構(gòu)造。關(guān)鍵的一點(diǎn)是，在一個(gè)給定的實(shí)驗(yàn)室必須保持細(xì)胞功能的最佳環(huán)境，提供了一個(gè)清晰的光學(xué)窗口，在其中捕捉到內(nèi)室發(fā)生的事件。由于實(shí)驗(yàn)變量到另一個(gè)，從一個(gè)調(diào)查不同的設(shè)計(jì)偏好，可以改變，最好的方法是測(cè)試各種不同的系統(tǒng)，以便確定一個(gè)是最適合于該細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)條件。

溫度控制

所有活細(xì)胞成像配置，可能出現(xiàn)的困難進(jìn)line實(shí)驗(yàn)時(shí)，溫度明顯不同于周?chē)膶?shí)驗(yàn)室環(huán)境（注意，溫度波動(dòng)在活細(xì)胞成像通常是規(guī)則，而不是例外）的準(zhǔn)備工作需要。細(xì)胞的功能是對(duì)溫度變化極為敏感，甚至一對(duì)夫婦的具有深遠(yuǎn)影響的程度，對(duì)細(xì)胞生理變化。有多種方法可用于溫度控制的細(xì)胞在顯微鏡舞臺(tái)上，許多的上述商業(yè)系統(tǒng)，包括加熱元件直接耦合到所述室。雖然這一戰(zhàn)略提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的集成解決方案，溫度控制往往局限于室本身，而忽略相關(guān)的組件，可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，對(duì)保持一個(gè)穩(wěn)定的溫度。其中與溫度波動(dòng)最重要的因素是顯微鏡階段，框架和物鏡可以充當(dāng)散熱片和抵消試樣加熱系統(tǒng)的努力。這個(gè)問(wèn)題是復(fù)雜的，當(dāng)浸沒(méi)物鏡的光耦合的介質(zhì)，它可以是油，甘油，水，這是因?yàn)槔镁哂懈叩枚嗟臒釋?dǎo)率比空氣。加上高數(shù)值孔徑物鏡的接近的接近度的試樣，以及物鏡本身的熱負(fù)荷，整個(gè)系統(tǒng)可以迅速地被剝奪熱量，如果物鏡不是熱控制。區(qū)直屬的物鏡在上述靜態(tài)室的情況下，往往是至5度（攝氏）的溫度比所述試樣腔室的其余部分。

根據(jù)配置，整個(gè)顯微鏡可以用加熱，但幾個(gè)臨界溫度控制的問(wèn)題，可以簡(jiǎn)單地通過(guò)使用市售的物鏡加熱器（參見(jiàn)圖3），采用循環(huán)加熱的水或電阻加熱元件避免。目的加熱器，與合適的試樣加熱系統(tǒng)相結(jié)合時(shí)，可以部分抵消試樣和前透鏡元件之間的溫度梯度。然而，請(qǐng)注意，即使有一個(gè)客觀的加熱器，可以仍然是沿客觀桶之間的物鏡和顯微鏡本身的溫度梯度。（b）是圖3（a）和圖3中示出的可調(diào)節(jié)的加熱毯和循環(huán)水套的物鏡加熱器基本上是相同的，從熱力學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看。唯一的區(qū)別是電產(chǎn)生的熱量在橡皮布（圖圖3（a）），而外部產(chǎn)生的熱和由流體轉(zhuǎn)移到夾套的物鏡（圖3（b））。在這兩種情況下，熱傳導(dǎo)是相對(duì)低效的，大部分的熱輻射相差的直接下方的檢體，而不是被轉(zhuǎn)移到的物鏡的物鏡的區(qū)域。不幸的結(jié)果是過(guò)多的外部熱對(duì)流向上引導(dǎo)的標(biāo)本在附近產(chǎn)生較大的溫度變化和過(guò)度的熱循環(huán)試驗(yàn)箱控制系統(tǒng)。

顯微鏡物鏡作為其物理參數(shù)的功能，不同的隔熱型材。大多數(shù)物鏡是設(shè)計(jì)和銷售為目的的固定細(xì)胞顯微鏡（在室溫下進(jìn)line），因此選擇物鏡時(shí)，被聘用在活細(xì)胞成像，應(yīng)小心考慮這些物鏡的能力，以有效地加熱。循環(huán)加熱系統(tǒng)除了從客觀加熱問(wèn)題，可以改變蓋玻片位置，導(dǎo)致標(biāo)本飄散出焦。此外，研究人員應(yīng)知道，反復(fù)加熱和冷卻的物鏡已被錯(cuò)誤地報(bào)告大大縮短的壽命，特別是在內(nèi)部透鏡元件的無(wú)應(yīng)變字符。事實(shí)上，很少有可靠的證據(jù)表明，溫度循環(huán)影響的應(yīng)變特征在專門(mén)的物鏡，也最能承受的溫度高達(dá)攝氏50度，而不會(huì)損壞。唯一的負(fù)面影響，加熱顯微鏡物鏡的后退止動(dòng)筒潤(rùn)滑劑的粘度增加（達(dá)到的柔韌性口香糖），在較短的一段時(shí)間比與不加熱的物鏡。然而，浸油的傾向，蠕變到桶通常在溫水浸泡物鏡的情況下，原來(lái)的潤(rùn)滑油的壽命延長(zhǎng)。

永久性安裝，一大盒可圍繞顯微鏡，與暖空氣加熱。在這種情況下，大多數(shù)的顯微鏡可以平衡到一個(gè)單一的溫度提供的優(yōu)點(diǎn)是消除顯微鏡部件的熱膨脹產(chǎn)生的任何移動(dòng)。然而，空氣流周?chē)脑嚇忧皇冶旧硪脖仨毐蛔钚』?。在?gòu)建的外殼時(shí)，訪問(wèn)顯微鏡和可調(diào)元件可能是有限的，所以它可能是值得框中，然后從比較普遍和廉價(jià)的元件構(gòu)造的情況下，需要重大修改。

最后要考慮的是嚴(yán)格控制溫度不僅在顯微鏡，也是整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。現(xiàn)代顯微鏡制造范圍廣泛的材料，包括鋁，塑料，復(fù)合材料，玻璃，黃銅，鋼，所有這些都具有不同熱膨脹系數(shù)。甚至一個(gè)單一度的變化可以產(chǎn)生多余的動(dòng)作，在顯微鏡的光學(xué)列車(chē)，產(chǎn)生焦點(diǎn)或?qū)?yīng)位移。顯微鏡現(xiàn)在的位置鄰近的空調(diào)或供暖管道往往會(huì)產(chǎn)生局部溫度波動(dòng)的影響，最終導(dǎo)致聚焦問(wèn)題。對(duì)于長(zhǎng)期的觀察，許多研究者建立一個(gè)大型的舞臺(tái)周?chē)暮銣乜刂葡洌ㄒ?jiàn)上面的討論），或在一個(gè)房間里，保持在37攝氏度（相對(duì)不舒服的工作情況），甚至將整個(gè)顯微鏡。確切的戰(zhàn)略最終取決于特定的應(yīng)用程序，但它絕對(duì)是至關(guān)重要的，在一個(gè)活細(xì)胞成像系統(tǒng)將被安置在它的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)時(shí)考慮這些問(wèn)題。

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的注意事項(xiàng)

當(dāng)選擇一個(gè)房間，將用來(lái)進(jìn)line活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，這是必要的，以確保有足夠的通風(fēng)可消耗臭氧釋放的汞和氙弧放電燈，以及用于清洗的有機(jī)溶劑的煙霧從光學(xué)表面和消毒，在顯微鏡階段。周?chē)舫鲎銐虻目臻g，適當(dāng)?shù)耐L(fēng)，以及清潔的地面，長(zhǎng)椅，桌子，和實(shí)驗(yàn)裝置的顯微鏡系統(tǒng)。設(shè)備故障通常可以追溯到進(jìn)氣口被堵塞，靠近地板，或者放置在一個(gè)人跡罕至的位置。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)精心保持干凈，并保持在一種有序的方式，以減少水平的灰塵，煙霧，和其他破壞性的蒸汽，可以減少光學(xué)以及電子性能。為了減少由微生物活細(xì)胞培養(yǎng)污染的發(fā)生率，顯微鏡載物臺(tái)和周邊地區(qū)的應(yīng)定期用70％乙醇或商業(yè)消毒毛巾擦拭。文化媒體泄漏，在活細(xì)胞室操縱一個(gè)不可避免的因素，應(yīng)立即清洗及周邊地區(qū)進(jìn)line徹底消毒。

在機(jī)械振動(dòng)源，可以影響顯微鏡的性能是中央供暖和制冷機(jī)組通過(guò)附近的走廊（或空氣處理）在閣樓或屋頂上的建筑，冰箱，低溫恒溫箱（甚至在相鄰的房間），和交通。冰箱和其他來(lái)源，可能不會(huì)立即明顯的振動(dòng)可以對(duì)顯微鏡的穩(wěn)定造成了嚴(yán)重的影響。多種技術(shù)可以應(yīng)用，以減少空間和建設(shè)的低頻振動(dòng)，包括反饋控制的隔離表，充氣（最昂貴的選擇）和成本相對(duì)較低的靈活的合成高分子隔振墊（見(jiàn)圖4） 。后者被銷售中的各種幾何形狀和阻尼水平，以適應(yīng)廣泛的配置。半英寸的鋁或一個(gè)預(yù)先鉆好的隔振平臺(tái)的振動(dòng)片和一個(gè)重片的組合通常會(huì)降低振動(dòng)無(wú)法察覺(jué)的程度。雖然倒組織培養(yǎng)顯微鏡幀重得多，而且通常不太敏感的振動(dòng)與直立顯微鏡相比，他們?nèi)匀皇芤娓綦x。，在許多情況下，高頻率的振動(dòng)可以通過(guò)加載表的頂部與附加質(zhì)量，如鉛磚大幅減少。最后，當(dāng)子分辨率的功能是非常小的位移受調(diào)查者，額外的步驟可能被要求，如工作在深夜或清晨，當(dāng)環(huán)境比較安靜。

除了穿過(guò)樓板的振動(dòng)進(jìn)line，還必須考慮可能的空氣源。據(jù)報(bào)道，原本穩(wěn)定的設(shè)備上產(chǎn)生麻煩振動(dòng)高分辨率顯微鏡設(shè)備冷卻風(fēng)扇或空調(diào)扇在實(shí)驗(yàn)室，甚至從附近的車(chē)輛（通過(guò)實(shí)驗(yàn)室窗玻璃進(jìn)line），排氣噪聲。激光冷卻風(fēng)扇等主要設(shè)備的振動(dòng)也能影響活細(xì)胞成像工作站。之間放置冷卻風(fēng)扇和激光頭的一段柔性導(dǎo)管?？梢杂行г谌ヱ铒L(fēng)扇振動(dòng)。在灌注和地心吸力媒體系統(tǒng)，振動(dòng)由于氣體鼓泡通過(guò)喂食解決方案可以通過(guò)油管標(biāo)本室，并產(chǎn)生周期性的機(jī)械位移。噪音也可以是一個(gè)源的振動(dòng)和降低顯微鏡穩(wěn)定性。單位應(yīng)及時(shí)更換風(fēng)扇噪音和其他設(shè)備，往往會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的噪聲（也可能是振動(dòng)），如果可line的話，應(yīng)該搬遷到另一個(gè)房間。顯微鏡通常配備有內(nèi)置的光源，電力變壓器，可以逐漸加熱顯微鏡幀，并產(chǎn)生一個(gè)緩慢的焦距漂移試樣。

室溫原本穩(wěn)定的活細(xì)胞的顯微鏡成像系統(tǒng)中的控制是另一個(gè)主要關(guān)注的問(wèn)題，可記錄時(shí)間推移序列時(shí)遇到的最重要的問(wèn)題之一。局限于一個(gè)小，通風(fēng)不好的房間，一臺(tái)顯微鏡，可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)拇髿鉁囟壬仙?。光源，溫度控制器，百葉窗，攝像頭，電腦和其他設(shè)備產(chǎn)生的熱負(fù)荷可能超過(guò)標(biāo)稱容量的房間，需要一個(gè)輔助冷卻系統(tǒng)的服務(wù)。額外的冷卻，提高了操作的所有電子設(shè)備，只要它不引入額外的振動(dòng)和灰塵。在這方面，將冷卻風(fēng)扇的顯微鏡系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)和高速的磁盤(pán)驅(qū)動(dòng)器的容量可能變得不足機(jī)箱充滿了產(chǎn)生熱量的卡，如那些用于相機(jī)控制器，圖像處理軟件，和額外的內(nèi)存。存在的問(wèn)題主要表現(xiàn)為系統(tǒng)崩潰，噪音增加，在最壞的極端情況下，丟失的數(shù)據(jù)。增加一個(gè)低噪聲的框中，然后風(fēng)扇的計(jì)算機(jī)殼體通常能夠減少這一困難。

雖然現(xiàn)代反組織培養(yǎng)顯微鏡（那些最青睞活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)）被設(shè)計(jì)成堅(jiān)實(shí)的單機(jī)儀器通過(guò)了大量的工程設(shè)計(jì)工作，以盡量減少振動(dòng)源，售后的輔助組件可以經(jīng)常危及這種固有的穩(wěn)定性?？焖倏扉T(mén)和濾光器變換器（濾光輪）在操作過(guò)程中產(chǎn)生的顯著水平的振動(dòng)，并直接連接到顯微鏡的幀時(shí)，往往引起擾動(dòng)，可以持續(xù)幾十到幾百毫秒。此外，許多研究級(jí)顯微鏡通常含有內(nèi)置的電動(dòng)組件（物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)，重點(diǎn)控制等），可以振動(dòng)源，除非廠家限制的速度，這樣的設(shè)備和/或引進(jìn)機(jī)動(dòng)功能之間的延遲和圖像采集。從輔助元件的振動(dòng)可以顯著減少甚至消除獨(dú)立地在不同的的臺(tái)燈相鄰顯微鏡通過(guò)安裝這些設(shè)備。剛性鋁光學(xué)面包板市售含預(yù)鉆安裝孔，是理想的住房都顯微鏡及配套組件。

焦點(diǎn)漂移

顯微鏡焦平面從活細(xì)胞中的連續(xù)的圖像的收集過(guò)程中的軸向位置的波動(dòng)的時(shí)間推移顯微鏡中最嚴(yán)重，最經(jīng)常遇到的問(wèn)題之一。通常被稱為焦點(diǎn)的漂移，在顯微鏡焦平面的變化通常發(fā)生由于在成像室或房間內(nèi)的溫度變化中，該文書(shū)被容納。廣義定性分析顯微鏡的熱狀態(tài)和焦平面位置之間的關(guān)系表明，1度（攝氏）的溫度增加或減少約一個(gè)半微米（500納米），可以轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)。凹凸的表面在玻璃蓋玻片上，以及齒輪滑動(dòng)，潤(rùn)滑脂層的壓縮，顯微鏡的運(yùn)動(dòng)部件之間的穩(wěn)定，但通常不關(guān)注的一個(gè)主要來(lái)源，也可以向集中的漂移所產(chǎn)生的機(jī)械不穩(wěn)定性。沒(méi)有反饋裝置連續(xù)監(jiān)視和正確對(duì)焦的漂移最好的補(bǔ)救措施之一是采用恒溫控制的外殼完全融入顯微鏡和相關(guān)組件。雖然它未能取得留在短的時(shí)間內(nèi)，無(wú)需輔助設(shè)備，高比例較長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)的圖像序列，由于注重漂移失敗。在幾乎所有的情況下，通常可以被追蹤顯微鏡光學(xué)列車(chē)的蓋玻片或溫度梯度的彎曲的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致的失敗作為源。

擊敗焦點(diǎn)漂移應(yīng)該是一個(gè)主要的考慮時(shí)間推移成像顯微鏡的配置過(guò)程中，尤其是當(dāng)使用高數(shù)值孔徑狹窄的聚焦深度（約300納米）的物鏡需要一個(gè)焦點(diǎn)的位置保持在100納米初始平面。整個(gè)系統(tǒng)，包括顯微鏡，攝像頭，百葉窗，濾光輪，照明，活細(xì)胞室總成，和主機(jī)工作溫度應(yīng)提請(qǐng)至少24至48小時(shí)，前啟動(dòng)時(shí)間推移成像序列。當(dāng)裝配成像室，確保含有貼壁細(xì)胞的蓋玻片上牢固地安裝在其外殼的腔室本身是不允許無(wú)論是在橫向或軸向方向移動(dòng)的方式定位在舞臺(tái)上。在成像分辨率高，油浸物鏡可以是源的焦點(diǎn)漂移，跨油腔室蓋玻片和鏡頭前端部件（干的物鏡沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題）。客觀加熱器，如上所述，應(yīng)使用所有的配置，采用浸泡物鏡。一旦顯微鏡是在正確的操作溫度和所有其他設(shè)備的實(shí)驗(yàn)上演過(guò)了一段12至24小時(shí)，使用一個(gè)固定和永久安裝的試樣，監(jiān)測(cè)重點(diǎn)的初步時(shí)間推移順序?qū)⑻峁┮粋€(gè)極好的指示系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

顯微鏡和廠家售后的各種市售的軟件和硬件解決方案已經(jīng)******與之抗衡的焦點(diǎn)漂移。的硬件設(shè)備是測(cè)量的物鏡的前透鏡之間的距離和反射的下表面接近的表面上的物鏡（蓋玻片）的試樣通過(guò)檢測(cè)光或聲音的自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)。然而，這種方法可以被阻礙，用于高分辨率的油浸物鏡時(shí)，由于對(duì)比度和反射率作為傳感的光穿過(guò)油的損失。最先進(jìn)的自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)使用低強(qiáng)度的近紅外線激光或發(fā)光二極管（LED）源，以反映的照明光束，通過(guò)物鏡和蓋玻片的上表面上（支持細(xì)胞和培養(yǎng)基中沐浴），隨后回收的物鏡的反射光，并把它傳遞給一個(gè)檢測(cè)器控制的反饋電路來(lái)調(diào)整位置的物鏡有關(guān)的蓋玻片培養(yǎng)介質(zhì)接口。

試樣的位置的瞬時(shí)值反饋使毫秒的時(shí)間間隔中被檢測(cè)到的觀察過(guò)程中，從而自動(dòng)地校正聚焦實(shí)時(shí)漂移的蓋玻片和物鏡之間的距離。這些系統(tǒng)是特別有用的，在終止焦點(diǎn)漂移產(chǎn)生的溫度降低時(shí)發(fā)生的變化和灌流培養(yǎng)基或添加試劑（如藥物）的文化。此外，持續(xù)關(guān)注修正成像檢查細(xì)胞，以確定候選人是促進(jìn)了多點(diǎn)圖像采集過(guò)程中的觀察和設(shè)置位置在翻譯階段。軟件附帶的自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)，可自由選擇焦平面通過(guò)調(diào)整偏置控制。由于使用長(zhǎng)波長(zhǎng)的激光或發(fā)光二極管光源，近紅外檢測(cè)系統(tǒng)不侵入用于觀察的波長(zhǎng)上，應(yīng)該是不可見(jiàn)的熒光檢測(cè)器。

圖5中所示的是一個(gè)典型的自動(dòng)對(duì)焦漂移校正機(jī)制為一個(gè)倒置的組織培養(yǎng)顯微鏡（圖5（a）），與比較常見(jiàn)的熒光蛋白的熒光發(fā)射公司與自動(dòng)聚焦激光器的波長(zhǎng)光譜的光譜窗口示意圖線（圖5（b））。聚焦到物鏡的后焦平面的激光（或發(fā)光二極管）具有指定的偏移量，并介紹其中心軸線平line。的定位反饋回路分鐘幾何從蓋玻片上表面和培養(yǎng)基之間的界面被反射的光束的位置變化，由于焦距偏移進(jìn)line校正。在圖5中所述的光譜發(fā)射曲線（二）代表一些最有用的熒光蛋白覆蓋的波長(zhǎng)范圍在450和700納米之間，包括增強(qiáng)型青色（ECFP），綠色（EGFP），黃色熒光蛋白（EYFP），作為礁珊瑚以及紅移的變種，單體Kusabira橙（MKO）和mCherry。熒光蛋白的信號(hào)不干擾的焦點(diǎn)漂移校正系統(tǒng)所使用的770納米的激光線。

在激光掃描共聚焦顯微鏡焦點(diǎn)漂移校正的時(shí)間推移的調(diào)查期間通常是通過(guò)獲得在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的多軸向的圖像與圖像堆棧的每一個(gè)隨后的分析，以確定到一個(gè)預(yù)先選定的參考點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)共同的焦平面。其他方法使用軟件算法來(lái)決定使用對(duì)比功能，記錄影像的連續(xù)向上和向下的步驟，并比較結(jié)果，直到獲得最高水平的對(duì)比（在這一點(diǎn)上，間隔）將焦點(diǎn)設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)之間的焦點(diǎn)位置。軟件技術(shù)依賴于一個(gè)相對(duì)恒定的水平，標(biāo)本的對(duì)比，然而，這往往是沒(méi)有的情況下，活細(xì)胞成像碎片等文物可以隨意漂浮到視場(chǎng)改變明顯的最佳焦平面。

光毒性和光損傷

除了毒性的發(fā)生是由于合成的熒光基團(tuán)和熒光蛋白的過(guò)度表達(dá)的濃度過(guò)高，健康長(zhǎng)壽的最佳標(biāo)記的細(xì)胞在顯微鏡成像室也可以受到由眾多其它有害因素。其中最重要的是，被熒光標(biāo)記的細(xì)胞反復(fù)暴露到從激光器和高強(qiáng)度的電弧放電燈的照明光引起的損傷（光毒性）。在它們的激發(fā)態(tài)，熒光分子傾向于與分子氧反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，可以破壞亞細(xì)胞成分和危及整個(gè)電池。此外，一些報(bào)告表明，特定的成分的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，包括維生素核黃素和氨基酸色氨酸，也可能導(dǎo)致不利的光誘導(dǎo)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。熒光蛋白，由于這樣的事實(shí)，他們的熒光基團(tuán)的保護(hù)的多肽包絡(luò)線內(nèi)被深埋，一般都不會(huì)對(duì)細(xì)胞的光毒性。然而，許多合成的熒光基團(tuán)，如Mitotracker有和核染色（Hoechst公司，SYTO花青染料，DRAQ5），可以高度即使是相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)照射時(shí)的細(xì)胞毒性。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，熒光團(tuán)，表現(xiàn)出激發(fā)波長(zhǎng)最長(zhǎng)，應(yīng)選擇以盡量減少破壞細(xì)胞短波照明。

圖6給出了標(biāo)記的合成的熒光團(tuán)或熒光融合蛋白的表達(dá)的細(xì)胞的照明光毒性誘導(dǎo)的三個(gè)例子。正常兔腎細(xì)胞（RK-13 ），如圖6所示（a）在第一轉(zhuǎn)染融合載體的EGFP和SV40病毒T抗原核靶序列本地化細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光。其后，將細(xì)胞治療用20分鐘Mitotracker有紅CMXRos，順序地想像在30秒的時(shí)間間隔為24小時(shí)。幾個(gè)小時(shí)后，液泡開(kāi)始形成含有線粒體圍繞原子核的地區(qū)。如圖6所示（b）是一個(gè)單一的表達(dá)mCherry熒光蛋白融合到人類的β -肌動(dòng)蛋白經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)的觀察人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U-251線）。注意細(xì)胞進(jìn)入壞死發(fā)生的顯著惡化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。支隊(duì)瑞士白化小鼠胚胎成像下面一個(gè)小時(shí)的治療與DNA結(jié)合的核的Hoechst 33342染色后的細(xì)胞（3T3線）被描繪在圖6（c）。紫外線吸收核染料（例如Hoechst公司）通常表現(xiàn)出光毒性作用更迅速地比在可見(jiàn)光譜中，在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)被激發(fā)的探針。

如上所討論的，合成的生物緩沖劑HEPES已報(bào)告的，以產(chǎn)生光毒性在某些情況下對(duì)細(xì)胞的影響（雖然在許多情況下，這可能是由于更直接的碳酸氫鹽水平不足）。調(diào)查員應(yīng)該記住，所有的細(xì)胞在本質(zhì)上感光，并加入到培養(yǎng)基中的化合物靈敏度熒光團(tuán)或芳香成分。通過(guò)激發(fā)態(tài)的熒光基團(tuán)產(chǎn)生的自由基損害的只能是有限的，無(wú)法阻止。然而，健康的細(xì)胞有內(nèi)在的自由基，減少有害化合物的酶的機(jī)制，并能容忍熒光激發(fā)他們的酶系統(tǒng)不飽和。培養(yǎng)基中減少氧的水平，提供了細(xì)胞的生存氧氣撤回，可以起到限制的漂白度和自由基的產(chǎn)生的雙重目的。

不管潛在的細(xì)胞，酶處理所產(chǎn)生的熒光基團(tuán)和培養(yǎng)基成分的毒性，細(xì)胞暴露在光線在成像設(shè)置應(yīng)減少到盡可能低的水平，以限制其他來(lái)源的細(xì)胞的損傷，并盡量減少在實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)物的可能性。每幅圖像的照明劑量可以通過(guò)明智的中性密度過(guò)濾器中的應(yīng)用受到限制電弧放電燈，照明光源（激光器）的輸出功率降低，快門(mén)組件的編程限制僅在暴露于熒光激發(fā)光圖像采集。此外，熒光濾波器帶寬應(yīng)仔細(xì)選擇，以減少不必要的波長(zhǎng)的數(shù)目和強(qiáng)度，將照亮細(xì)胞與光，是沒(méi)有用的成像。使用高數(shù)值孔徑物鏡，采用了最好的的光吞吐量和光學(xué)元件最少的幫助下成功地降低照明水平在活細(xì)胞成像能力。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的敏感性，紫外線燈照射的熒光基團(tuán)的情況下，即使在被記錄（稱為光損傷的現(xiàn)象），和許多細(xì)胞系至少是同樣用來(lái)激發(fā)青色和綠色的波長(zhǎng)區(qū)域，藍(lán)色光敏感熒光蛋白質(zhì)。成像實(shí)驗(yàn)中，必須要在最低的光水平下可以觀察到細(xì)胞的活細(xì)胞在顯微鏡配置的可視化，應(yīng)盡可能快地進(jìn)line時(shí)，為了盡量減少光損傷和光毒性。應(yīng)使用中性密度濾光片（或非常低的激光功率），以衰減的最佳方式是與數(shù)字成像系統(tǒng)的照明源和可視化的細(xì)胞。通過(guò)顯微鏡目鏡觀察細(xì)胞需要花費(fèi)幾秒鐘，這是在至少十倍長(zhǎng)于往往是必需的，獲得的圖像具有足夠的質(zhì)量，用于小區(qū)選擇和聚焦。另外，使用明場(chǎng)，相襯，微分干涉對(duì)比（DIC）的成像模式，可位于候選細(xì)胞成像。在所有情況下，應(yīng)使用綠色或紅色的干擾濾波器，在安裝過(guò)程中，以提高對(duì)比度和降低細(xì)胞暴露藍(lán)色光。

活細(xì)胞成像研究的546納米（綠色）的廣泛應(yīng)用過(guò)濾器的起源，因?yàn)檫@個(gè)波長(zhǎng)區(qū)域相匹配的主要汞弧光放電燈發(fā)出的光譜線。然而，實(shí)現(xiàn)適當(dāng)水平的光照強(qiáng)度是很少有問(wèn)題的活細(xì)胞的調(diào)查和現(xiàn)代化的物鏡被修正到這種程度，他們并不需要使用高分辨率成像綠燈。因此，應(yīng)限于最好由細(xì)胞的耐受性在各區(qū)域的照明波長(zhǎng)的選擇。緊接細(xì)胞分裂（前期），大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是非常敏感的紫外光和紅外光，是最不敏感的紅色，綠色和藍(lán)色光，以遞減順序。因此，為了盡量減少光損傷，紅色600納米和650納米之間的區(qū)域用一個(gè)帶通干涉濾光片是活細(xì)胞觀察的理想選擇。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的自體熒光，也降低了在可見(jiàn)光光譜中的較長(zhǎng)的波長(zhǎng)。請(qǐng)注意，光學(xué)分辨率是依賴于波長(zhǎng)和紅光收益率最低的理論值由于波長(zhǎng)較長(zhǎng)參與分辨率。然而，在大多數(shù)情況下，使用的紅色光不是限制因素，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞成像的分辨度經(jīng)常會(huì)損害細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，溫度漂移，在光學(xué)系統(tǒng)中的缺陷，以及照明波動(dòng)。

活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)在選擇過(guò)濾器，帶寬應(yīng)精心挑選的紅外線和紫外線，即使痕量水平被淘汰。盡管現(xiàn)代的帶通濾波器的設(shè)計(jì)表現(xiàn)良好的可見(jiàn)光光譜中的中部地區(qū)，他們往往通過(guò)非常低和非常高的波長(zhǎng)的輻射。因此，建議安裝專門(mén)的玻璃過(guò)濾器，阻止有害的紫外線和紅外線波長(zhǎng)附近的照明源（s）。汞，并在較小程度上，氙燈產(chǎn)生大量的紫外線，而鎢鹵燈發(fā)出的（發(fā)送的）顯著量的紅外光。作為最后一個(gè)步驟，安裝電子快門(mén)（鹵鎢燈和電弧放電燈）限制暴露的細(xì)胞損害的輻射期間，沒(méi)有被捕獲圖像時(shí)。明智的模板的照明源是成功的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中的最重要的因素之一。

檢測(cè)技術(shù)在過(guò)去幾年進(jìn)展是可line的，在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步降低照明水平。不斷推出越來(lái)越敏感的光電倍增管陰極共聚焦顯微鏡和先進(jìn)的電荷耦合器件（CCD）相機(jī)系統(tǒng)廣角鏡。集約化和電子倍增攝像系統(tǒng)現(xiàn)已能輕是極其低的水平，與高靈敏度活細(xì)胞成像。許多這些相機(jī)采用薄型背照式CCD的，通常冷卻功能，高量子效率在整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外光譜區(qū)域，以進(jìn)一步提高靈敏度。如果最好的相機(jī)都無(wú)法使用，靈敏度可提高相結(jié)合，來(lái)自多個(gè)像素的信號(hào)（在這個(gè)過(guò)程被稱為分檔）的空間分辨率為代價(jià)的。在激光共聚焦顯微鏡，保持縮放比例較低水平會(huì)降低光毒性細(xì)胞。增加共焦的變焦倍率，使總要掃描的激光光量的試樣在一個(gè)較小的區(qū)域，從而將細(xì)胞暴露到更強(qiáng)烈的光照。

選擇光衰減的確切程度和正確的曝光時(shí)間幾乎都是經(jīng)驗(yàn)性的練習(xí)。對(duì)于一個(gè)新的細(xì)胞系含有未知參數(shù)，最好的策略，以盡可能多地衰減光，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使所獲取的圖像是勉強(qiáng)可見(jiàn)，適用于很短的曝光時(shí)間。一個(gè)好地方，開(kāi)始是一個(gè)中性密度濾光片，光學(xué)密度為1.0，曝光時(shí)間為100毫秒或更短。激光掃描共聚焦顯微鏡，用激光功率約1％，并開(kāi)始增加電壓（增益，如果必要的話）的光電倍增管。使用像素停留時(shí)間縮短約50％，比那些通常會(huì)產(chǎn)生足夠的信號(hào)電平。如果該細(xì)胞是通過(guò)長(zhǎng)期的時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛉萑踢@種光的水平，然后在照度和曝光時(shí)間可以慢慢增加在隨后的實(shí)驗(yàn)中，直到信號(hào)與噪聲和細(xì)胞存活率之間實(shí)現(xiàn)可line的折衷辦法。應(yīng)該指出的是曝光的單元格可以容忍，個(gè)別的曝光時(shí)間的長(zhǎng)度的總量之間通常存在非線性關(guān)系。在一般情況下，細(xì)胞是最健康的，當(dāng)暴露在非常短暫的脈沖光，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間曝光（大于半秒）在很長(zhǎng)一段時(shí)間，往往是致命的。

監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力和變異

與新鮮細(xì)胞的活細(xì)胞成像腔室已被加載后，組裝，安裝在顯微鏡載物臺(tái)上，下一個(gè)步驟是，以可視化的細(xì)胞，建立其整體狀況和形態(tài)，并確定適當(dāng)?shù)某上竦暮蜻x。在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，尤其是在最近的成像細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光蛋白，將是一個(gè)顯著的細(xì)胞群的形態(tài)變異量。它并不少見(jiàn)要么沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞觀察或表現(xiàn)較差的本地化探頭。此外，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的百分比將超額表達(dá)熒光蛋白，經(jīng)常點(diǎn)創(chuàng)建一個(gè)潛在的毒性作用。其他細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)出常見(jiàn)的健康問(wèn)題表現(xiàn)在從基板脫離的形式，過(guò)多的空泡形成，線粒體腫脹，胞質(zhì)小泡（圖7中所示）。在不同文化中相同的細(xì)胞系可以顯示不同圖案的釘珠和出泡，這可能是一個(gè)癥狀，不同的應(yīng)激因素。健康狀況下降，往往會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的速度，通常會(huì)導(dǎo)致活動(dòng)普遍減少。然而，健康狀況不佳并不總是顯示細(xì)胞活性下降，受損的細(xì)胞可以表現(xiàn)出明顯增加，類似布朗的細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞顯示出即使是輕微的偏離正常和健康的外觀不應(yīng)追求成像和數(shù)據(jù)收集。此外，如果超過(guò)50％的人口被判斷為異常，整個(gè)培養(yǎng)應(yīng)被丟棄，一個(gè)更好的生理?xiàng)l件交換。

許多活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)只有一個(gè)，頂多幾個(gè)細(xì)胞。調(diào)查人員應(yīng)牢記培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)，可以很方面存在明顯的表型變化。這種異質(zhì)性的結(jié)果，細(xì)胞生長(zhǎng)周期的不同階段，或可能是內(nèi)在的差異，個(gè)別成員的人口（小學(xué)文化，后者更明顯）。出于這個(gè)原因，它往往是要記錄數(shù)據(jù)，從單個(gè)細(xì)胞數(shù)，以獲得一個(gè)統(tǒng)計(jì)上顯著的細(xì)胞line為和動(dòng)態(tài)采樣。正如上面所討論的，研究者應(yīng)當(dāng)牢記，在活細(xì)胞觀測(cè)的成像條件必須是最低限度，為了不顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的細(xì)胞擾動(dòng)?；罴?xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下判斷的健康細(xì)胞研究，使實(shí)驗(yàn)的成功，可以客觀評(píng)估。確切的條件會(huì)有所不同，這取決于實(shí)驗(yàn)，但要考慮的最重要因素之一是所預(yù)期的結(jié)果是否達(dá)到無(wú)損傷成像過(guò)程中所產(chǎn)生的細(xì)胞。在某些情況下，所研究的現(xiàn)象可以與固定細(xì)胞得到的結(jié)果相匹配，但是這往往是不可能的。

應(yīng)監(jiān)測(cè)成像實(shí)驗(yàn)，以確保在實(shí)驗(yàn)條件（培養(yǎng)基，緩沖策略，大氣，腔室配置）基本上不改變細(xì)胞的生長(zhǎng)率，有絲分裂指數(shù)，或凋亡性質(zhì)。如果可能的話，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組件的潛在負(fù)面影響，應(yīng)分別評(píng)估。例如，細(xì)胞生長(zhǎng)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的二氧化碳培養(yǎng)箱用于成像實(shí)驗(yàn)的可line性，有絲分裂指數(shù)和判斷在培養(yǎng)基中，和一般的形態(tài)變化。作為最后的檢查，細(xì)胞可以被安裝在無(wú)光照的環(huán)境成像室為若干小時(shí)，然后同樣地評(píng)估。這種策略隔離的各種貢獻(xiàn)一般細(xì)胞的健康，容易識(shí)別任何需要修改的程序。

如上所述，細(xì)胞暴露于高劑量的照明在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，那些標(biāo)有熒光團(tuán)可能可敬的產(chǎn)生會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞功能的活性分子種類。的假設(shè)，至少一些已發(fā)生的損害程度，應(yīng)采取在成像實(shí)驗(yàn)步驟期間，以確定它是否足以產(chǎn)生不利的影響是顯著的，因此，它是安全的（和審慎的）。這是最好的離開(kāi)細(xì)胞成像室，與隨后的定期檢查，以確定細(xì)胞是否啟動(dòng)凋亡或進(jìn)入并完成有絲分裂的實(shí)驗(yàn)完成后，在顯微鏡舞臺(tái)上完成。在實(shí)驗(yàn)后的評(píng)估過(guò)程，可以記錄的影像時(shí)間推移，在廣泛分布的時(shí)間間隔（10至30分鐘），超過(guò)的小時(shí)數(shù)。

用于確定細(xì)胞存活率依賴于適當(dāng)?shù)耐緩街写嬖诘臉?biāo)準(zhǔn)下檢查細(xì)胞。一些轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株有倒閉的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，使測(cè)定有絲分裂和細(xì)胞凋亡無(wú)用的進(jìn)展。不同的細(xì)胞類型應(yīng)仔細(xì)評(píng)估，以確定可line性評(píng)估與顯微鏡下成像序列，可用于標(biāo)準(zhǔn)。其中最簡(jiǎn)單的檢測(cè)之后的成像實(shí)驗(yàn)是比較明顯的健康和在調(diào)查期間沒(méi)有受到照射在相同的腔室與相鄰小區(qū)的已暴露在光線下的細(xì)胞形態(tài)。兩個(gè)種群相襯或DIC觀察時(shí)，類似的功能是一個(gè)很好的跡象，一般健康狀況還沒(méi)有被攻破。這一觀察結(jié)果與熒光成像，熒光團(tuán)定位，以確定是否已經(jīng)改變了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)遵循。最后，應(yīng)間歇地觀察到這兩種細(xì)胞群體幾個(gè)小時(shí)（天）后的實(shí)驗(yàn)，看看如果細(xì)胞進(jìn)line成像，同樣地line為的非成像的細(xì)胞。這種類型的比較往往揭示是否已發(fā)生重大損害下的細(xì)胞研究。

檢查的有絲分裂通路在活細(xì)胞成像是一個(gè)很好的機(jī)制，用以監(jiān)測(cè)細(xì)胞光損傷。細(xì)胞有絲分裂周期才剛剛開(kāi)始啟動(dòng)染色體凝集（前期）過(guò)度照明損壞時(shí)，往往不能進(jìn)入早中期，隨后完成細(xì)胞分裂。掃描文化與微分干涉對(duì)比顯微鏡操作模式可以揭示這些細(xì)胞開(kāi)始有絲分裂，實(shí)際實(shí)驗(yàn)成像條件下仔細(xì)觀察，可以分離出一個(gè)合適的人選。如果染色體進(jìn)line質(zhì)解聚的觀察期間內(nèi)，不能在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)重新進(jìn)入有絲分裂的細(xì)胞，是一個(gè)很好的光損傷的可能性發(fā)生。請(qǐng)注意，改變培養(yǎng)基質(zhì)解聚在許多細(xì)胞的前期染色體也將啟動(dòng)，因此這種分析應(yīng)進(jìn)line幾個(gè)小時(shí)后，細(xì)胞被放置在顯微鏡舞臺(tái)上。細(xì)胞系差異很大，他們的忍受能力在有絲分裂過(guò)程中的光。建立人類和動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)可以對(duì)光線極其敏感的細(xì)胞來(lái)自胚胎（如果蠅和線蟲(chóng)），而往往缺乏逮捕分裂周期的途徑，在DNA損傷反應(yīng)和更寬容的光損傷。

除了光損傷和光毒性，以及嚴(yán)格的維護(hù)要求現(xiàn)任活細(xì)胞成像相關(guān)的眾多問(wèn)題，研究者也必須要警覺(jué)到的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中微生物污染的可能性。最常見(jiàn)的感染的發(fā)生是由于細(xì)菌，真菌，支原體，酵母菌，霉菌，在罕見(jiàn)的情況下，原生動(dòng)物。除非它變成一個(gè)頻繁的事件，參與的感染或物種的性質(zhì)是不一樣重要的確定污染的來(lái)源。在一般情況下，快速生長(zhǎng)的微生物是由于這樣的事實(shí)，它們通常是很容易檢測(cè)和培養(yǎng)可以迅速丟棄問(wèn)題較少。更重要的是這些感染的存在是神秘的，無(wú)法可視化的文化，因?yàn)樵诔Ｒ?guī)檢查的物理尺寸，或使侵略者逃脫檢測(cè)水平增長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中的抗生素的過(guò)度使用是一個(gè)共同的問(wèn)題，通常會(huì)導(dǎo)致一個(gè)低級(jí)別的污染，它可以保持很長(zhǎng)一段時(shí)間未被發(fā)現(xiàn)，最終可能會(huì)干擾正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能。

列于圖8是顯微照片，示出三個(gè)最常見(jiàn)的可見(jiàn)活細(xì)胞培養(yǎng)物中的微生物污染來(lái)源。未經(jīng)檢查的細(xì)菌的生長(zhǎng)（圖8（a））在高放大倍率（通常伴隨著在培養(yǎng)基中的pH值的快速下降），很容易檢測(cè)到，甚至可以被可視化的生物體編號(hào)開(kāi)始時(shí)在培養(yǎng)基中的濁度用肉眼就可以到達(dá)飽和度。酵母（圖8（b））增加速度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)菌，但有一個(gè)明顯的殖民主義的動(dòng)機(jī)，揭示了他們的存在。霉菌污染（圖8（C））通常在24至48小時(shí)之內(nèi)，超越文化，往往可以被認(rèn)定為一個(gè)濃密，纖維的入侵。然而，也許是污染最嚴(yán)重的形式，是不顯著對(duì)比增強(qiáng)用常規(guī)的顯微鏡技術(shù)（相襯和DIC）。支原體（圖中未示出）可以嚴(yán)重地改變細(xì)胞的line為和代謝，但不是通過(guò)逐漸惡化的跡象，常常是細(xì)微的其他在細(xì)胞培養(yǎng)中是不容易確定。應(yīng)定期進(jìn)line支原體檢測(cè)，確保文化的活細(xì)胞成像這一嚴(yán)重神器。揭示支原體的存在下，包括熒光染色（核染料Hoechst的），聚合酶鏈反應(yīng)和放射自顯影的各種檢測(cè)方法是有用的。

時(shí)間推移成像

于1909年由法國(guó)博士生的學(xué)生讓Comandon，誰(shuí)提出的最早報(bào)道時(shí)間的推移，梅毒螺旋體，查理·卓別林的前5年他的第一部電影的電影片引入動(dòng)態(tài)成 像的生物活性。Comandon的技術(shù)，他稱之為microcinematography，使捕獲事件在微觀世界，可以狂奔到一個(gè)脆弱的暗視野顯微鏡使用一個(gè)巨大的電影攝影機(jī)記錄的電影生產(chǎn)。這些電影證明器樂(lè)教學(xué)醫(yī)師如何區(qū)分疾病造成螺旋體是無(wú)害的，并演示了如何時(shí)間推移觀察，可以采用無(wú)追索權(quán)獲得重要的生物信息，圖像分析，處理，甚至是經(jīng)驗(yàn)的定量測(cè)量。在未來(lái)75年中，許多的顯微鏡適應(yīng)日益先進(jìn)的電影膠片相機(jī)，顯微鏡，以便產(chǎn)生更好的薄膜高得多的分辨率。

由于管為主的視頻攝像機(jī)成為負(fù)擔(dān)得起在20世紀(jì)70年代后期和20世紀(jì)80年代早期，研究人員開(kāi)始用光學(xué)顯微鏡夫婦這些設(shè)備產(chǎn)生模擬時(shí)間推移圖像序列的實(shí)時(shí)視頻。管攝像機(jī)最終讓位面陣CCD在20世紀(jì)90年代初，預(yù)示著一個(gè)新時(shí)代的顯微攝影和信令的電影的最終消亡。憑借先進(jìn)的數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)可在21世紀(jì)，日益流line的技術(shù)時(shí)間推移cinemicrography的捕獲事件發(fā)生在活細(xì)胞中的期間范圍從幾秒鐘至數(shù)周（甚至幾個(gè)月）越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)涉及重復(fù)成像的細(xì)胞培養(yǎng)在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，從而提供了無(wú)數(shù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程經(jīng)常發(fā)生的時(shí)間尺度分布廣泛的信息。當(dāng)時(shí)間推移調(diào)查耦合到標(biāo)記細(xì)胞合成熒光基因編碼的熒光蛋白質(zhì)，亞細(xì)胞和分子水平上的事件可以調(diào)查。

時(shí)間推移成像可以在兩個(gè)空間維度，使用廣角技術(shù)，并進(jìn)一步延長(zhǎng)，甚至三維成像，激光共聚焦顯微鏡。此外，現(xiàn)代的共聚焦顯微鏡配備了線掃描軟件的快速和反復(fù)的單次掃描線成像。二維時(shí)間推移成像涉及順序捕獲單個(gè)焦平面（X - Y廣角鏡和x - ?，所述 - ?，? - ?在激光共聚焦顯微鏡），而三維成像光學(xué)堆疊多個(gè)焦點(diǎn)平面厚的樣品在各種尺寸的格式。當(dāng)在橫向平面（x和y的）單一的焦點(diǎn)是結(jié)合作為時(shí)間的函數(shù)的z堆棧成像，該技術(shù)被稱為一個(gè)4-D的時(shí)間推移成像。同樣，增加第五個(gè)維度（波長(zhǎng)）產(chǎn)生5-D成像，而加入的2,4-D的堆棧中的多個(gè)波長(zhǎng)或多個(gè)橫向區(qū)域被稱為6-D時(shí)間推移成像。如上所述，順序的圖像采集的時(shí)間間隔，使用這些技術(shù)的范圍可以從毫秒到幾天甚至幾個(gè)月。

越來(lái)越多的小分子，重要的合成產(chǎn)生高度特異性的細(xì)胞或亞細(xì)胞標(biāo)記圖案的熒光探針，現(xiàn)在市售。此外，巨大的努力，以產(chǎn)生有用的熒光蛋白，具有生成樹(shù)的可見(jiàn)光和近紅外光譜的發(fā)光顏色開(kāi)始生產(chǎn)令人鼓舞的結(jié)果。綠色熒光蛋白及相關(guān)光譜變量現(xiàn)在經(jīng)常被融合到其他感興趣的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)地理，運(yùn)動(dòng)，血統(tǒng)，以及在活細(xì)胞生物化學(xué)透露細(xì)節(jié)。在此方面，這些生物探針提供了一個(gè)重要的新的方法來(lái)了解蛋白質(zhì)的功能，這是一個(gè)合乎邏輯的步驟細(xì)胞過(guò)程的調(diào)查，現(xiàn)在許多生物體的基因組序列已被確定。許多熒光蛋白的固有亮度和耐光性，使它們非常適用于需要重復(fù)的成像時(shí)間推移研究?？傊?，合成和基因編碼的熒光探針，得到一個(gè)看似無(wú)休止的可能性陣列成像在活細(xì)胞的分子組成。

如圖9所示是一個(gè)24小時(shí)的時(shí)間推移順序兔腎上皮細(xì)胞（RK-13 ）被抓獲結(jié)合使用熒光和微分干涉對(duì)比幾個(gè)圖像。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的嵌合體mCherry熒光蛋白融合到人的β -肌動(dòng)蛋白，以顯示這個(gè)細(xì)胞骨架的成分分布在主細(xì)胞身體以及lamellapodia的。圖9中的白色箭頭（一）表示細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞的中心區(qū)域的大池附近的皺褶的啟動(dòng)。序列過(guò)程中，小皺褶開(kāi)始膨脹，擠壓朝左手側(cè)的圖像，在波浪狀運(yùn)動(dòng)，集中明亮的標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白的融合蛋白，因?yàn)樗脑鲩L(zhǎng)（由箭頭表示在進(jìn)入前緣圖9（b）至圖9（d））。，由于lamellapodium擴(kuò)散到覆蓋面積大，前緣后面的小簇標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白的形式（在圖9（e）和圖9（f）條中的箭頭），在結(jié)構(gòu)元件可能podosomes的過(guò)程中參與細(xì)胞粘附到玻璃基板上。

時(shí)間推移成像技術(shù)的顯著的關(guān)鍵顯微鏡輔助元件，如電子光快門(mén)，濾光片輪，電動(dòng)載物臺(tái)，和焦點(diǎn)的漂移校正機(jī)制，它可以協(xié)調(diào)和控制由一臺(tái)主機(jī)計(jì)算機(jī)，使用市售的圖像采集應(yīng)用程序的幫助下的軟件。電子快門(mén)是必要的以阻止相機(jī)曝光之間的試樣的照射成像時(shí)，熒光標(biāo)記的細(xì)胞，以盡量減少光損傷，光毒性，光漂白，這樣可以極大地延伸的圖像的質(zhì)量在很長(zhǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞存活率通常用在時(shí)間失效的實(shí)驗(yàn)。同時(shí)成像的多個(gè)熒光基團(tuán)，以及結(jié)合的熒光和DIC成像，要求電動(dòng)濾光輪，可以迅速在一些熒光過(guò)濾器和/或偏振片之間切換。在實(shí)踐中，激發(fā)照明控制由一個(gè)包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的帶通激發(fā)濾光片的濾光輪，而收集到的第二個(gè)過(guò)濾器輪容納無(wú)論是帶通或長(zhǎng)通屏障過(guò)濾器（發(fā)射）的熒光發(fā)射。物鏡下方的，多個(gè)帶通二色鏡安裝到協(xié)調(diào)通過(guò)一個(gè)單一的，固定光學(xué)元件的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的同時(shí)通過(guò)阻擋和反射。先進(jìn)的濾光輪可以在相鄰的過(guò)濾器在30至50毫秒之間切換與具有操作規(guī)格的電子快門(mén)，在同一范圍內(nèi)，這是在時(shí)間推移序列的連續(xù)圖像之間的最短的時(shí)間間隔確定的限制因素。

在共聚焦顯微鏡中，時(shí)間推移采集圖像的掃描反射鏡的速度是有限的。掃描速率最高達(dá)到減少圖像的像素尺寸，采用光柵速度最快可在儀器上，但通常僅限于約8到10幀每秒。在較短的時(shí)間間隔收集圖像序列需要單線掃描，掠場(chǎng)的儀器，或旋轉(zhuǎn)磁盤(pán)顯微鏡?，F(xiàn)代紡紗磁盤(pán)和掠場(chǎng)顯微鏡可以定期捕獲圖像序列，在高利率，介乎一至幾百幀每秒，通常只有有限的數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)或光電倍增的速度。這些儀器的設(shè)計(jì)，以適應(yīng)主機(jī)高速非常低光照時(shí)間推移成像實(shí)驗(yàn)中的變量。

結(jié)論

活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)可以非常強(qiáng)大，但他們也可以顯著受益于互補(bǔ)調(diào)查采用固定細(xì)胞檢測(cè)，以協(xié)助在活細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象的驗(yàn)證。雖然這可能似乎有悖常理，由于活細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞和分子動(dòng)力學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)常舉line這樣的事實(shí)，在調(diào)查期間的技術(shù)困難和破壞細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)可以基本上克服了類似的結(jié)果，如果在動(dòng)力學(xué)和時(shí)間點(diǎn)事件可以被固定的細(xì)胞與驗(yàn)證。在許多情況下，比較固定的細(xì)胞，活細(xì)胞成像是完全不可能的，無(wú)論是因?yàn)橐粋€(gè)事件的動(dòng)力學(xué)速度過(guò)快或?qū)嶒?yàn)的性質(zhì)（例如，動(dòng)態(tài)），因?yàn)椴荒苓M(jìn)line有意義的固定細(xì)胞內(nèi)進(jìn)line。此外，點(diǎn)活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示事件或?qū)傩远紱](méi)有進(jìn)line觀測(cè)或固定細(xì)胞容易解釋。然而，它是值得考慮使用這種方法作為一種技術(shù)用于監(jiān)測(cè)事件看出，在較長(zhǎng)的時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)不存在有害影響擴(kuò)展照明。

現(xiàn)代儀器使成像高信號(hào)噪聲比使用非常低的水平，在入射光的活標(biāo)本，目前作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)的分子動(dòng)力學(xué)。成像技術(shù)的不斷進(jìn)步和熒光探針的設(shè)計(jì)增強(qiáng)了電源的這種做法，并確保其未來(lái)在現(xiàn)代生物學(xué)中的一個(gè)重要工具。儀器儀表的技術(shù)和觀念上的進(jìn)步，也可能推高時(shí)空分辨率的新限制，以及完善的模式在目前使用的熒光顯微鏡。的幾個(gè)最近推出的方法，如受激發(fā)射損耗的4Pi顯微鏡，看來(lái)是有前途的活細(xì)胞成像的技術(shù)，但其在生物應(yīng)用中廣泛使用的潛力還沒(méi)有被建立，并且有限制的厚度可接受的標(biāo)本。然而，在最后的分析中，技術(shù)服務(wù)和所需的專業(yè)知識(shí)與目前可用的儀器進(jìn)line了成功的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的可能性很大，甚至有可能進(jìn)步，仍然存在著許多障礙。