徠卡顯微鏡：CARS顯微鏡的簡介

2020-09-04 09:27:11

共聚焦和多光子成像技術(shù)仍然是對生物樣品進行復(fù)雜的研究方法的首選。這些技術(shù)的典型的結(jié)構(gòu)或動態(tài)過程可視化生物樣品中取決于標(biāo)本中現(xiàn)有的自體熒光物質(zhì)或合適的熒光染料的可用性。傳統(tǒng)的染色方法的缺點是顯而易見的：標(biāo)簽是耗時的，并隨著時間的推移的染料漂白。此外，他們失去強度和改變樣品。染料往往造成光毒性，損害試樣，因此影響的實驗結(jié)果。CARS（相干反斯托克斯拉曼散射）顯微鏡是一種無染料的方法，該方法通過顯示特征的固有振動，其分子中的對比度的圖像結(jié)構(gòu)。至關(guān)重要的這種方法的優(yōu)點是樣品仍然幾乎不受影響。

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三波混頻實驗

相干反斯托克斯拉曼散射的第一個錄音回到上世紀(jì)6os，當(dāng)兩個科學(xué)實驗室的研究人員在福特CARS公司，PD Maker和RW特休恩，發(fā)表了一篇關(guān)于他們的實驗。他們只是稱他們的作品“三波混頻實驗”。幾乎10年后，在20世紀(jì)70年代中間，RF貝格利，AB，斯坦福大學(xué)的哈維和RL拜爾表現(xiàn)出優(yōu)勢的CARS，在拉曼光譜和首次申請對生物樣品。從那時起，CARS的發(fā)展已經(jīng)是必然的。在1999年，A.宗布什，GR霍爾頓和謝，XS報道關(guān)于“振動顯微鏡使用相干反斯托克斯拉曼散射”，及后Potma的和謝的文章寫在2004年“CARS生物學(xué)和醫(yī)學(xué)”的相干反斯托克斯拉曼散射技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域已抵達(dá)。

同時，在2004年剛剛二十出版物關(guān)于CARS的數(shù)量增加超過75去年，包括越來越多的應(yīng)用與生物和醫(yī)學(xué)背景。

CARS的物理背景

CARS是一個三階非線性的過程，涉及的泵光束的頻率ω P的頻率的斯托克斯束的ω S =2ω p - ω ●后的反斯托克斯頻率ω處的信號中產(chǎn)生的相匹配的方向。樣品被刺激通過波混頻過程。在CARS的振動對比時，將創(chuàng)建的頻率差Δω=ω p - ω s之間的泵浦光束和斯托克斯束相干驅(qū)動一個特定的化學(xué)鍵和振蕩與該鍵的分子的分子振動的頻率等于。

CARS信號被樣品中的分子所產(chǎn)生的振動運動。沒有外部的標(biāo)記物是需要得到一個CARS圖像。不同類型的分子特征振動能量狀態(tài)。在適當(dāng)?shù)模t外線）波長的電磁能量將分子激發(fā)到這些國家。為了產(chǎn)生足夠的信號噪音以上，造CARS理念填充特征振動狀態(tài)，首先從基態(tài)抽成一個虛擬的狀態(tài)。這是通過照明用“泵”光束在介質(zhì)中的波長（ωP）。光子的能量必須是小于從基態(tài)到第一激發(fā)態(tài)的差異。當(dāng)?shù)诙馐ㄋ雇锌怂沽海┰谳^長波長（ωS）同時發(fā)光，分子被迫從虛擬狀態(tài)成隨意的振動狀態(tài)。由于泵浦光束是可調(diào)的，剩余差額ωΔ=ωP-ωS可以具體地調(diào)整到所需的振動能量有關(guān)的分子。在本質(zhì)上，所需的分子人口被轉(zhuǎn)換成振動狀態(tài)。以可視化的分子，泵束提高E-系統(tǒng)的能量ωP+ωΔ到第二個虛擬的狀態(tài)。從這里開始，分子被允許返回到基態(tài)放松，而能源ωP+ωΔ=ωAS檢測到（反斯托克斯束）。這些光子被用于成像。

CARS詳細(xì)過程

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圖 1：第1步：發(fā)出（強烈）光（很多）的分子上創(chuàng)建虛擬狀態(tài)。此燈將許多分子泵，被稱為泵束的（ωP）的。第2步：發(fā)出（強烈）的光到分子與適當(dāng)?shù)哪芰縼?/span>“刺激滅絕”的虛擬狀態(tài)。這種能量是斯托克斯能量（小于激發(fā)）。因此，光的斯托克斯束（ωS）。

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圖 2：這雙照明的后果是人口密集振動子基態(tài)的狀態(tài)，這是非常具體的化學(xué)性質(zhì)。選擇調(diào)諧調(diào)諧泵浦光束。

Figure-3

圖 3：為了形象化人口稠密的振動狀態(tài)，我們使用了泵浦光束為探針分子提升到一個新的虛擬狀態(tài)。（不需要任何動作，光線仍然是）

Figure-4

圖 4：分子從這個虛擬的狀態(tài)放松到基態(tài)時，能量大于泵，因而更藍(lán)“比泵，因此被稱為”反斯托克斯“。這是檢測到的信號。

F-CARS和E-CARS

CARS信號可以被檢測到兩個不同的方向：

1.Forward CARS（F-CARS），與透射光探測器檢測

與精確定義的過濾器設(shè)置在檢測到信號的相位匹配的方向。F-CARS信號一般都非常強，往往很強烈的非共振背景（來自周邊溶劑），可區(qū)分清楚的。Forward CARS是適用于薄的樣品。

2.Epi CARS（E-CARS）

如果弱F-CARS信號所掩蓋的非共振背景，在向后方向上的檢測，從而降低了噪聲的圖像的對比度可以提高。E-CARS是特別敏感的是小于光波長的焦點的對象。高散射樣品時，可以是正方向傳播的CARS信號的反向散射，導(dǎo)致強烈的外延信號。

什么是CARS顯微鏡？

共聚焦和多光子成像技術(shù)，生物樣品中典型的結(jié)構(gòu)或動態(tài)過程可視化，并依賴于現(xiàn)有的自體熒光物質(zhì)使試樣或提供合適的熒光染料。其結(jié)果是，新的染料需要分析生物樣品中的未知的和潛在的相關(guān)細(xì)節(jié)。

染色標(biāo)準(zhǔn)的熒光樣品往往是費時且昂貴的化學(xué)方式，因為他們的行為，并可能影響活細(xì)胞的典型特性。此外，染料失去強度和改變樣品。往往容易引起光毒性，損害試樣，并因此可能影響實驗結(jié)果。

CARS克服這些缺點的方法所固有的特性。CARS不要求標(biāo)注，因為它是高度特異性的分子化合物，這是基于振動對比度和化學(xué)選擇性。至關(guān)重要的這種方法的優(yōu)點是樣品仍然幾乎不受影響。

與CARS，現(xiàn)在新的樣本，不能因得不到適當(dāng)?shù)娜玖先旧?/span>

通過CARS技術(shù)集成到共聚焦系統(tǒng)中，常規(guī)的顯微鏡技術(shù)的缺點是可以克服的。最新的商業(yè)發(fā)展的結(jié)果，在一個易于使用和高效的為各種各樣的生物和非生物樣本成像顯微鏡。兩個紅外激光束，正是在調(diào)整的空間和時間屬性產(chǎn)生不同波數(shù)的輝煌CARS圖像。CARS過濾器和非退探測器的一對夫婦的組合允許在向前的（外延）的方向，以及在向后的檢測。的二次諧波產(chǎn)生（SHG）的記錄可以同時進行。常規(guī)和高速掃描儀支持組合視頻速率的動態(tài)過程以及在高分辨率的形態(tài)學(xué)研究分析。

應(yīng)用 - 生物學(xué)，食品，化妝品

生物學(xué)

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圖 5：食品蛾體內(nèi)成像（谷螟interpunctella）。此圖像顯示表面的幼蟲絲腺。疊加圖像的紅色的部分為脂質(zhì)成分（在2850厘米-1），而綠色的幾丁質(zhì)產(chǎn)生的自體熒光，在波長為1064 nm。示出的幼蟲在中間圖像頂部的刷毛。物鏡：HCX IR APO L25x/0.95 0.17 W

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圖 6：食品蛾體內(nèi)成像（谷螟interpunctella）。表面的幼蟲絲腺，10倍的放大倍率。疊加層上的圖像的左側(cè)顯示紅色的部分為位于中的綠色區(qū)域的圖像的右側(cè)上所示的角質(zhì)層下的脂肪細(xì)胞。規(guī)律的角質(zhì)層是由自體熒光成像在波長為1064 nm。長的細(xì)絲周圍腺體幼蟲的表面位于刷毛。圖片已采取與816 nm和1,064 nm的兩個通道。物鏡：HC PL APO 10x/0.4 CS。

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圖 7、8：在酵母細(xì)胞的體內(nèi)成像。已采取了在兩個不同的波數(shù)的圖像。物鏡：HCX IR APO L25x/0.95 W 0.17。圖7：在一個星期的舊培養(yǎng)基:酵母細(xì)胞。脂滴是小，由于缺少糖。明亮的藍(lán)色部分是酵母細(xì)胞內(nèi)脂滴（-1 2850厘米）。

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圖 8：酵母細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)了三個多小時。結(jié)果表明，有足夠的糖，可用于細(xì)胞的大脂滴。深藍(lán)色部分所產(chǎn)生的水的3,250 cm -1的波數(shù)。

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圖 9：在果蠅的幼蟲果蠅體內(nèi)成像。脂肪細(xì)胞顯示為紅色，在波數(shù)2850厘米-1（在816 nm）。兩種不同的結(jié)構(gòu)顯示綠色自發(fā)熒光（1,064 nm處）長管是氣管系統(tǒng)，條紋無論在后臺的肌肉。物鏡：HCX IR APO L25x/0.95 W 0.17。