尼康顯微鏡：在光學(xué)顯微鏡標(biāo)本的對比

生物體和類似的透明，未染色標(biāo)本的高分辨率光學(xué)顯微鏡通常遭受缺乏對比，使這些標(biāo)本幾乎看不見明照明模式。使用的顯微鏡物鏡的全孔徑，未染色的標(biāo)本的圖像是非常差的，即使是透明的周期性結(jié)構(gòu)的衍射光柵，對齊的纖維，集成電路副本，如絲狀藻類，硅藻。

雖然透明標(biāo)本通常相互作用的光散射和衍射光束通過誘導(dǎo)相移，這些對象仍然在顯微鏡看不見的，因?yàn)槿说难劬o法檢測到不同的階段。樣本，除非是高度著色的染料染色，可為顯微鏡，唯一的選擇是顯著減少聚光鏡工作的數(shù)值孔徑，通過關(guān)閉可變光闌。然而，這種極端的措施將大大削弱物鏡的分辨率。

現(xiàn)代顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，能夠生產(chǎn)高清晰度的圖像，在高放大倍率，但沒有足夠的對比度在圖像這樣的能力是毫無價值的。對比度是不是標(biāo)本的固有特性，但依賴于相互作用的檢體的光耦合到它能夠可靠地記錄的圖像信息用合適的檢測器的光學(xué)系統(tǒng)的效率。顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中的圖像對比度的控制是取決于幾個因素，包括正確的設(shè)置的開口的隔膜，光學(xué)像差的程度，對比度機(jī)制，不同的試樣，和檢測器的特性的。除了專門的對比增強(qiáng)配件，有幾個地點(diǎn)顯微鏡，使操作員能夠調(diào)整對比度。的光學(xué)系統(tǒng)中最關(guān)鍵的是該字段和聚光鏡的孔徑光闌設(shè)置，但對比度也可以通過改變電子照相機(jī)（或傳統(tǒng)的乳膠膜）γ，改變視頻檢測器的放大倍數(shù)，在實(shí)時圖像處理操作，以及標(biāo)本染色。

因?yàn)槿搜鄹兄膶ο笤谄鋱D像產(chǎn)生的對比度，可能會導(dǎo)致一定程度的混亂，除非有先驗(yàn)知識的光中發(fā)生的事件產(chǎn)生圖像中的對比度。圖1示出了一系列的三個在透射光中包含一個透明的，幾乎無色的Zygnema絲狀藻類根據(jù)不同的對比度模式的相同的視場模式下拍攝的數(shù)字圖像：明場，相襯和微分干涉對比。三個數(shù)字圖像顯得相當(dāng)不同，顯微鏡，因?yàn)檫@些變化，可能會得出不同的結(jié)論從每個視場的獨(dú)立審查。

圖1（a）中示出的藻類燈絲，在明視場模式下操作，通過顯微鏡成像與聚光鏡光圈縮小尺寸足以使邊緣可見，露出內(nèi)部的一些細(xì)節(jié)。雖然綠色葉綠體內(nèi)的燈絲的肋可以區(qū)分，圖像一般患有整體上缺乏對比度。一個相同的相位對比光學(xué)捕獲視場的絲狀藻類，在圖1（b）。請注意，一系列肋，環(huán)狀結(jié)構(gòu)，似乎是兩個組排列的，高對比度的球形形狀顯露是在圖1（a）中的葉綠體。在一般情況下，圖像顯示暗區(qū)域所包圍的暈，這是一種常見的工件在相襯顯微鏡。施加通過解Sénarmont補(bǔ)償?shù)钠靡粋€小的程度與使用微分干涉顯微鏡成像圖1（c）中所示的長絲。試樣遮光介紹了在一側(cè)而另一邊是明亮，導(dǎo)致的偽三維圖像的感知的圖像中出現(xiàn)黑暗的補(bǔ)償結(jié)果。圖1中的每個視場提供了一個不同的標(biāo)本圖像的解釋稍有不同，它只能被破譯知識顯微鏡如何創(chuàng)建這些圖像。

吸收光（自然地或通過添加合成染料介導(dǎo)的）產(chǎn)生的顏色或不同的試樣的亮度對比度的明視野顯微鏡的制造一直是經(jīng)典方法。術(shù)語“ 對比度“是指一個單獨(dú)的標(biāo)本細(xì)節(jié)的能力來加以區(qū)分時相比，背景或其他相鄰功能。效果，對比度定義為檢體圖像的光強(qiáng)度之間和相鄰的背景，相對于整體的背景強(qiáng)度的差異。試樣屬性產(chǎn)生的亮度變化，或顏色的差異，產(chǎn)生的光的吸收，反射，空間變化折射率，散射，衍射，雙折射，熒光和類似的光學(xué)現(xiàn)象。在一般情況下，對比度的測量的最高和最低的圖像中的強(qiáng)度之間的關(guān)系，可以說是由一個簡單的公式：

Percent Contrast = [(Ib - Is)/Ib] x 100

I(b)是背景強(qiáng)度和I(s)是試樣的強(qiáng)度，對比度被調(diào)查的功能。從這個等式中，標(biāo)本的對比，是指圖像中的最高和最低的強(qiáng)度之間的關(guān)系，這是顯而易見的。如果試樣的強(qiáng)度（暗）比背景，對比度被稱為為陽性，而比背景亮的標(biāo)本，顯示負(fù)的對比度。當(dāng)標(biāo)本修改的光譜分布（顏色）的光通過時，它會產(chǎn)生顏色對比度。這類對比試樣緊密間隔的周期性結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的白色光的干涉。

在圖2中示出的曲線圖標(biāo)本的對比的背景強(qiáng)度的效果。當(dāng)背景是很暗的灰度值（I(b) = 0.01;紅線），圖像強(qiáng)度的變化小，會產(chǎn)生對比度的大變化。通過減輕的背景有點(diǎn)淺灰色（I(b)等于0.10;綠線），圖像強(qiáng)度的微小變化，提供了一個有用的對比度范圍。在較亮的背景強(qiáng)度（I(b)大于或等于約0.50，藍(lán)線），圖像的對比度是相對不敏感的背景強(qiáng)度，并且圖像強(qiáng)度大的變化只產(chǎn)生小的增加或減少對比度。

在大多數(shù)情況下，背景和圖像強(qiáng)度的離散值，但在整個視場的變化，從而導(dǎo)致對比度波動。作為一個經(jīng)驗(yàn)法則，透明標(biāo)本明照明模式顯示約2％至5％的對比，而相位和微分干涉相襯圖像可以有15％和20％之間的對比度水平，只是略小于固定和染色標(biāo)本在明觀察到的照明（約25％）。相比暗場和熒光顯微鏡（對比平均水平的60％和75％，分別），相襯和微分干涉相襯照明生產(chǎn)整體對比度少，但仍然負(fù)擔(dān)相似程度的決議。

振幅和相位標(biāo)本

在本發(fā)明的的光學(xué)對比度增強(qiáng)技術(shù)，透射明場照明的最常用的觀察模式，在光學(xué)顯微鏡，尤其是對于固定，染色標(biāo)本或其他類型的可見光具有高的自然吸收的樣品之一?？偟膩碚f，的標(biāo)本容易地成像與明照明被稱為振幅對象（或標(biāo)本），因?yàn)檎彰鞯牟嚸娴恼穹驈?qiáng)度降低，當(dāng)光穿過試樣。

然而，對于許多標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡，尤其是未染色或有生命的物質(zhì)，對比是如此之差，試樣仍基本上是不可見的，而不管其目的是解決或明確分開的細(xì)節(jié)的能力。通常情況下，為這樣的標(biāo)本，重要的是不改變它們通過殺戮或治療與化學(xué)染料或固定劑。這必然導(dǎo)致的顯微鏡實(shí)驗(yàn)了一百多年，在以嘗試提高試樣的可見性，并帶來了更多的細(xì)節(jié)，而不改變試樣本身的圖像對比度增強(qiáng)技術(shù)。這是一個常見的做法是減少聚光鏡推薦的大小以下的孔徑光闌，或降低，以增加標(biāo)本的對比臺下聚光。不幸的是，雖然這些演習(xí)的確會增加對比，他們也嚴(yán)重降低的分辨率和清晰度。

在明照明光源（通常是鎢鹵素?zé)簦┖?/span>聚光鏡的位置，以填補(bǔ)物鏡前孔部分相干光的波陣面是相對于顯微鏡光軸對稱?；拥臉?biāo)本的染色區(qū)域的波陣面的幅度在減小，而試樣的衍射產(chǎn)生突出的第一級衍射邊帶，它是180度的相位與通過試樣的光通過。在形成圖像的過程中，在圖像平面與環(huán)繞光波的衍射邊帶干擾和背景上出現(xiàn)亮點(diǎn)，與吸收結(jié)構(gòu)在試樣表現(xiàn)出各種顏色和灰度級的色調(diào)。然而，當(dāng)未染色樣品的折射率與周圍介質(zhì)（通常簡稱為環(huán)繞），衍射光的波的強(qiáng)度顯著降低。此外，賦予由試樣放出的衍射波陣面的相位差的相對相位偏移了90度，而不是通常180度，觀察到具有高吸收標(biāo)本。這兩種效應(yīng)相結(jié)合，嚴(yán)重地限制了試樣的可見性。

如上所述，改變透射光的強(qiáng)度的試樣稱為振幅試樣，并在顯微鏡可以觀察到其吸收能力或影響的光的波的振幅的平方成正比的光強(qiáng)度，這是作為一個后果。其他顏色自然或人為化學(xué)染料染色的標(biāo)本，也可以清楚地成像在明照明。這些污漬或自然的顏色吸收的某些部分的白色光通過，其他顏色的透射或反射。通常情況下，污漬相結(jié)合，產(chǎn)生對比的顏色。例如，藍(lán)色蘇木素染色粉紅色的曙紅，選擇性污漬細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核往往是結(jié)合。它是一種常見的做法是利用標(biāo)本上的污漬不容易吸收光線，從而使這種在顯微鏡可見的圖像。

與此相反，不吸收光線，而是透明的標(biāo)本，通過被稱為相位對象（或標(biāo)本）的波陣面產(chǎn)生的相位變化。這些標(biāo)本幾乎是不可見的，圖像非常困難的，因?yàn)槿搜劭梢姽獠ㄖg的相對相移的變化不敏感。此外，眼睛無法檢測到包含電磁輻射的電場矢量的取向的變化，如偏振效應(yīng)，。相位標(biāo)本其特征在于以幾種標(biāo)準(zhǔn)，包括它們的形狀（通常為圓形或扁平），內(nèi)部的光散射元件的密度，厚度，和獨(dú)特的化學(xué)或電的結(jié)構(gòu)特性（統(tǒng)稱為折射率分組）。厚的樣品可以是相對透明的，僅包含少量的光散射元件，或者它們可能包含許多散射元素沒有光通過，并呈現(xiàn)有效地不透明的透射照明的試樣。這些標(biāo)本通常被稱為反射光的標(biāo)本。

相位的變化主要是由于檢體及其周圍介質(zhì)的厚度和折射率之間的差異。一個典型的例子是活的組織培養(yǎng)細(xì)胞，在光照下顯得幾乎是透明的。當(dāng)通過一個透明的試樣，在不被修改的照明光的波前在明視野顯微鏡，也不是試樣吸收的圖象形成的波。如果試樣是有點(diǎn)失焦，薄薄的灰度陰影所產(chǎn)生的折射光通過目鏡觀察。然而，當(dāng)被合適地聚焦顯微鏡，一個薄的，透明的標(biāo)本的圖像消失（試樣具有顯著的厚度繼續(xù)觀察由于折射光從眾多的焦平面沿光或z -軸）。

入射照明光的振幅和相位標(biāo)本上的效果在圖3中。最上面的正弦波圖中顯示了一個典型的不受干擾的光波（環(huán)繞）不通過標(biāo)本。通過只通過試樣安裝介質(zhì)的原狀光波的振幅和波長（具有折射率= n）圖中所示的（圖3（a））。當(dāng)光波輸入染色標(biāo)本周圍介質(zhì)具有相同的折射率（在圖3（b）所表示的綠色方塊），波遇到污漬的吸收減少的幅度作為結(jié)果，但它們的相對相位保持不變。然而，當(dāng)光波輸入的標(biāo)本，其折射率從周圍介質(zhì)中（圖圖3（c））是不同的，振幅不會受到影響，但是，大約90度的相位延遲。在現(xiàn)實(shí)中，大多數(shù)遇到的標(biāo)本表現(xiàn)出的振幅和相位的影響（圖3（d））的組合，產(chǎn)生的事件和新出現(xiàn)的光波的振幅和相位之間的關(guān)系的變化。

光程差和相位梯度

所經(jīng)歷的事件的波前通過透明標(biāo)本的光程差和相位梯度利用，充分利用幾個流行的對比度增強(qiáng)技術(shù)，包括相襯和微分干涉對比。在大多數(shù)情況下，入射波前部穿過試樣，但不通過周圍介質(zhì)中，或者是稍微超前或滯后，這取決于試樣和介質(zhì)的折射率之間的差。當(dāng)考慮差成像明照明，試件的作用，在改變波通過的光路長度（有效的相對相移）的透明的相位標(biāo)本是非常重要的。

觀察在培養(yǎng)容器中或夾在顯微鏡載玻片和蓋玻片之間的相位標(biāo)本的大部分是相對平坦的，或板狀，如圖4中所示為一個假設(shè)的試樣浸漬在均勻介質(zhì)中。在該圖中，試樣的厚度記為變量t和折射率為n(s)。周圍介質(zhì)的折射率為n(m) 。入射光波（黃色箭頭）接近的試樣，沐浴在其周圍介質(zhì)中，從左側(cè)的速度決定的折射率和厚度的商品通過。

當(dāng)光從一種介質(zhì)到另一種（例如，從成一個細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的水的營養(yǎng)組織培養(yǎng)基），速度改變兩種介質(zhì)的折射率之間的差異。因此，當(dāng)相干光通過聚焦鏡燈絲發(fā)射的波的相位標(biāo)本的厚度t和折射率n(s)，波可以是增加或減少速度。如果試樣的折射率大于周圍介質(zhì)，波速度降低，而通過試樣，隨后在相對的相位滯后時，從檢體出現(xiàn)?？蛇x地，當(dāng)周圍介質(zhì)的折射率超過試樣，波先進(jìn)的退出時試樣的相。

點(diǎn)亮旅客只通過試樣經(jīng)歷的光路（OP）是由該產(chǎn)品的試樣的折射率（n(s) ）和試樣的厚度（t）的。以類似的方式，只能通過遍歷周圍介質(zhì)的光波出差的光路距離等于乘以由折射率（t × n(m)）的介質(zhì)的厚度。之間的檢體及其周圍介質(zhì)中的光程差（OPD）可以表示為：

Optical Path Difference (OPD) = Δ = (t × ns - t × nm) = t × (ns - nm)

緊急檢體和周圍介質(zhì)中的波陣面之間的位置的差異被稱為相移（δ）和以弧度為單位，可以定義由下面的公式：

δ=2πΔ/λ

其中π是一個常數(shù)（3.142），λ是波長的光照射試樣。的光程差是兩個方面：在折射率（n）的厚度（t）的和之差的商品。在許多情況下的光程差可以是相當(dāng)大的，即使對象的厚度相當(dāng)薄。另一方面，當(dāng)檢體和周圍介質(zhì)的折射率是相等的，光程差為零，即使試樣的厚度是非常大的。在這種情況下，通過試樣的光的行進(jìn)只是延遲（相位差）相對于周圍介質(zhì)中的光通過的厚度相等。

相襯顯微鏡的設(shè)計，以利用檢體和周圍介質(zhì)中的各種組件之間的相位差。然而，它不是簡單的相位差，這是必要的，而且衍射試樣必須發(fā)生的相襯顯微鏡，產(chǎn)生一個合適的圖像。通過比較，微分干涉對比依賴于相位的梯度，在經(jīng)典的偽三維圖像的技術(shù)被廣泛地稱為否則透明的標(biāo)本對比度。

相位對象的最常見的形狀是一個連續(xù)變化的光路或密度，如在圖5中所示的半球狀的試樣。在這個例子中，可以數(shù)學(xué)近似的相位物體的側(cè)面，通過棱鏡的形狀，如下面所討論。被指定在圖5中的相位物體的折射率n(s)是周圍介質(zhì)中，n(m) 。激進(jìn)的幾何形狀相對象轉(zhuǎn)換只發(fā)生在邊緣A和B（參見圖5（a）條）。入射光影響的對象AB的平面垂直，而平面波陣面是平行于AB。

于1（圖5（a）中的圓角相位物體的頂點(diǎn)）的邊界基本上平行于入射的波前，而在A和B的邊界垂直。2區(qū)到4是微型棱鏡的相位對象（圖5（b）條）的圓形表面的切線定義的。“棱鏡”的角度訂單中的第2區(qū)域比在區(qū)域4，區(qū)域4'是相反的。邊緣à 乙衍射是最強(qiáng)的。

因此，多棱鏡組成的曲面狀或半球狀的試樣，在試樣的相對兩側(cè)有以相反的方向定向的棱鏡。最陡的棱鏡是在赤道上的球形試樣，用最少的斜率，而棱鏡分別位于頂部和底部。這些微型棱鏡組成的光學(xué)梯度：

OG (Optical Gradient) = Φ = α(ns - nm)

其中，α是相對于平面波陣面的切線的角度。請注意，光學(xué)梯度是兩個方面的商品：角（α）的光通過，雙方之間的折射率差（n(s) - n(m) ）。的光通過棱鏡改變方向的角度φ（見圖5（c）和圖5（d））。方向的變化可以很大，即使斜率或邊界梯度可能是小的，如果大的折射率差。如果是相同的折射率，光波通過透過相位物體unrefracted。離開棱鏡的光的方向依賴于相對差之間的相位物體及其周圍介質(zhì)中（n(m) ，參見圖5（c）和圖5（d）） （n(s) ）的 折射率的。

如上所述，舍入的相位對象不斷變化的光的梯度，并且每個單獨(dú)的光學(xué)梯度“棱鏡”中創(chuàng)建了一個不同的角度的光的偏轉(zhuǎn)。圖5（c）示出的偏轉(zhuǎn)方向時，周圍介質(zhì)的折射率大于的相位對象（n(m)> n(s) ），圖5（d）示出的情況正好相反的方向（n(m)<n(s) ）。成正比的角度偏轉(zhuǎn)，φ，的切線角度（α）的折射率之差（n(s) - n(m) ），使得 ：

tan φ = tan α (ns - nm)

對于小角度：

φ = α (ns - nm)（弧度）

要總結(jié)“棱鏡”的效果的光學(xué)梯度的邊界，當(dāng)相位物體的折射率超過周圍介質(zhì)，然后在每個斜坡的梯度的大小相等的對象在相同的角度偏轉(zhuǎn)。此偏轉(zhuǎn)角依賴于相對折射率差和幾何切線角度（α）。當(dāng)介質(zhì)的折射率（n(m) ）是大于對象（n(s) ）的折射率時，偏轉(zhuǎn)相反時，情況正好相反。當(dāng)沒有梯度，不存在光通過偏轉(zhuǎn)。

的邊緣梯度，以及檢體的厚度，無論樣品是否大致分類為振幅或相位，影響通過的光的波陣面的折射和衍射角。散射光的只有一小部分在此被捕獲的物鏡，是一個因素，取決于數(shù)值孔徑。剩余的散射光，這是不收集，表示標(biāo)本信息丟失所產(chǎn)生的影像。客觀的后側(cè)焦點(diǎn)面上的孔徑模仿為衍射光，必須集中在中間像平面進(jìn)行干擾和形成圖像的低通濾波器（影響大試樣的詳細(xì)信息）。因?yàn)閳A潤光滑的表面相標(biāo)本相對較少或沒有衍射網(wǎng)站，他們遭受重大缺乏對比成像時無需的輔助對比度增強(qiáng)光學(xué)元件的利益。

照度的一致性

當(dāng)考慮光的方法，以提高標(biāo)本的對比，它是有用的，考慮檢體的各種特性，可以被操縱來創(chuàng)建的強(qiáng)度變化，這將導(dǎo)致使試樣可見。一個主要的問題是將被改造成的對象有哪些特點(diǎn)了一套獨(dú)特的情況下的強(qiáng)度差異。

分試樣的細(xì)節(jié)和具有的尺寸近似的成像光的波長衍射或散射光的邊緣，提供有一個試樣及其周圍介質(zhì)之間的折射率差。折射率，光線通過空氣或除以光速的速度通過真空對象的速度比經(jīng)典定義。通過任何材料，因?yàn)楣獾乃俣仁切∮诠庠谡婵罩械乃俣?，折光率始終超過值1.0用顯微鏡標(biāo)本。為了解決小對象之間的距離，并重現(xiàn)其形狀與合理的保真度，必須被捕獲的大角度的衍射光顯微鏡物鏡。

物鏡收集衍射光（或背離）必須納入清晰的聚焦在圖像平面，以產(chǎn)生標(biāo)本細(xì)節(jié)。在圖像平面中，包含的衍射光的光波進(jìn)行與未衍射的光，通過和試樣周圍的干擾。干擾所產(chǎn)生的圖像的質(zhì)量高度依賴于相干光照射試樣，并顯著改善圖像質(zhì)量一般通過增加的連貫性。在光學(xué)顯微鏡下，部分聚光鏡孔徑光闌開口尺寸控制在試樣上入射的光的空間相干性。減小光圈大小產(chǎn)生一個更大的空間相干性。

照明光波至少是部分相干的試樣在圖像形成的衍射和干涉的作用是至關(guān)重要的，需要在各種形式的干涉光學(xué)顯微鏡，包括相位相反，微分干涉相差（DIC），和偏光。實(shí)際上，光波通過試樣（環(huán)繞或不偏離）和試樣的衍射產(chǎn)生相互連貫的字符程度，必須加以保護(hù)，使整個顯微鏡的光學(xué)列車和相消干涉，發(fā)生在圖像平面。

如白熾燈的鎢鹵素型光學(xué)顯微鏡中常用的，是有顯著數(shù)量的同相振動的波陣面在燈絲上的原產(chǎn)地從他們的角度的部分相干光源。通過熱燈絲產(chǎn)生的合奏，因?yàn)槊總€光子振動若干彼此同相，在一個給定的波陣面內(nèi)的實(shí)際的相干度僅僅是局部的。此外，浪表現(xiàn)出很強(qiáng)的一致性也是有限的距離只有幾十波長。其結(jié)果是，光波長程的振幅會表現(xiàn)出交替的高和低的狀態(tài)，波振動相干（同相）和瞬時滿分彼此同相，分別。長絲和弧光燈的情況可以比較受激發(fā)射的激光源，這是連貫的長距離（成千上萬甚至上百萬的波長），完全語無倫次的熒光發(fā)射產(chǎn)生的熒光標(biāo)記標(biāo)本。

連貫性的起源是來自于一個事實(shí)，即原子內(nèi)的微觀領(lǐng)域中的燈絲強(qiáng)烈互相影響時，它們被激發(fā)光子發(fā)射點(diǎn)。這些短程效應(yīng)導(dǎo)致局部同步發(fā)射發(fā)生在離散捆在整個長絲表面。其結(jié)果是，一種含鎢的鹵化物的白熾燈，或電離的等離子體電弧放電的汞的燃燒器的熱絲，可以描述為獨(dú)立發(fā)出光的協(xié)調(diào)突發(fā)微型原子的街區(qū)的合奏。個人沿著單一方位由燈絲產(chǎn)生的相干波前被稱為光射線或鉛筆?？评照彰?，聚光透鏡（定位后的燈管外殼，但在此之前在顯微鏡視場光闌，光學(xué)路徑）形成在臺下聚光的前焦面（光圈）的燈絲的圖像。該孔隨后變成部分相干波陣面，用來照亮物體面中，如在圖6中示出試樣的來源。

對于一個給定的光波入射在試樣上（參看圖6）中，存在相干關(guān)系之間的衍射和非衍射的波陣面（零階）通過試樣。保持這種關(guān)系之間的試樣和圖像平面，光波重組互相干擾。在那個位置，相干波伙伴語無倫次與其他波陣面產(chǎn)生的最終圖像。這個重要的概念的基礎(chǔ)的光學(xué)顯微鏡的許多形式，但相位和微分干涉對比技術(shù)是特別重要的，因?yàn)橥ㄟ^和相消干涉的圖像形成要求的照明的至少是部分相干的。換言之，必須存在一個明確的相位關(guān)系之間的環(huán)繞聲和衍射的光波，標(biāo)本和圖像平面之間的這種關(guān)系必須保留。

顯微鏡長期依賴，降低聚光鏡光圈開孔尺寸顆粒和邊緣相標(biāo)本，以提高知名度。振幅對象的對比度，也可以提高由聚光鏡孔徑適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。小物件，邊和粒子將衍射光，無論他們是否屬于振幅或相位標(biāo)本。的衍射光的只有一小部分在此被捕獲的物鏡（由于數(shù)值孔徑的限制），而其余沒有收集的衍射光表示的圖像信息丟失。聚光鏡光圈開孔尺寸正確的設(shè)置是增強(qiáng)的標(biāo)本圖像對比度和引進(jìn)衍射文物之間的權(quán)衡。后者表現(xiàn)的分辨率損失，衍射環(huán)的疊加，以及從在試樣中所沒有的共同焦點(diǎn)區(qū)域的其它不希望的光學(xué)效果。隨著接近衍射極限，圖像對比度被泄露的對象的詳細(xì)信息變得越來越小，空間頻率變高。

在光學(xué)顯微鏡下，來自作為照明光的波陣面和被檢體之間的相互作用的結(jié)果的對比，如何處理離開標(biāo)本的光，但并不是一個特定試樣的固有屬性。此外，顯著影響調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）和對比度產(chǎn)生模式的顯微鏡標(biāo)本的對比。調(diào)制傳遞函數(shù)是顯微鏡的能力，從檢體的信息傳輸?shù)綀D像的定量指標(biāo)。在一般情況下，圖像的對比度降低的試樣結(jié)構(gòu)具有較高的空間頻率（更細(xì)的和更緊密地間隔開的細(xì)節(jié)），無論顯微鏡的對比度機(jī)制或調(diào)制傳遞函數(shù)的。

結(jié)論

光能夠通過多種機(jī)制來生成圖像的對比度與樣品相互作用。這些包括反射的表面，吸收，折射，偏振，熒光，和衍射。顯微鏡的光學(xué)元件和照明模式的物理改性，以及最終的圖像通過照相或數(shù)字電子技術(shù)的操縱，也可以增加對比度。下面的討論突出各種檢體和光之間的相互作用，并審查了一些（見表1）的光學(xué)顯微鏡技術(shù)已被開發(fā)，以提高標(biāo)本的對比。表1總結(jié)的對比度增強(qiáng)技術(shù)（次）給出一個標(biāo)本和各種材料，研究了同時發(fā)射和反射的光鏡。此表可作為一個粗略的指南，在光學(xué)顯微鏡接近具體的成像問題。

人類的眼睛是非常敏感的檢體的振幅和波長中的差異。出于這個原因，許多標(biāo)本切成非常薄的部分（范圍從1?30微米的厚度），化學(xué)染料染色，可以提高對比度，來區(qū)分居住于試樣的結(jié)構(gòu)。此技術(shù)已相當(dāng)普遍用了幾百年的生物標(biāo)本。染料的選擇性吸收光從一個或幾個波長，并通過或反映其他所有波長。一個例子是吸收所有的可見光波長的藍(lán)色染料，藍(lán)色，反射和透過樣品的異常。的生物試樣的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件往往是染色用的染料，選擇性地染色這些元素的混合物，對材料是透明的或染色的，不同的顏色的背景下進(jìn)行的，增大對比度。

這些技術(shù)也適用于熒光染料，可用于增加對比度標(biāo)本中具有高度特異性。由一個或幾個波長的可見光或近紫外光激發(fā)熒光標(biāo)本時，他們經(jīng)常發(fā)出較長波長的光，從而成為可見的，或?qū)Ρ?，相對于其他對象在外地或在黑暗的背景?/span>

對比度增強(qiáng)技術(shù)，光學(xué)顯微鏡

表1

染色標(biāo)本的對比度增加的早期，但仍目前采用的方法，采用的色彩對比過濾器，雷登漆明膠平方（柯達(dá)），或在光路中的干涉濾光片。例如，如果有一個紅色的染色染色的標(biāo)本，綠色濾色器將變暗紅色區(qū)域，從而增加對比度。另一方面，綠色濾色器將減輕任何綠色的染色面積。彩色濾光片是非常有價值的輔助標(biāo)本的對比，尤其是黑色和白色的顯微攝影時是我們的物鏡。綠色過濾器是特別有價值的應(yīng)用與消色差透鏡物鏡，這是球校正綠燈。此外，在相襯物鏡內(nèi)部的相位板的設(shè)計，以延遲或提前特定波長，通常在550納米附近的（綠光）。

活標(biāo)本和其他相對象，這往往產(chǎn)生不良的圖像查看時，在明照明，清晰可見的光，而不是化學(xué)意味著霍夫曼調(diào)制相襯，對比度和微分干涉對比照明下觀察時。這些技術(shù)需要特殊的光學(xué)元件，顯微鏡，但通常會產(chǎn)生足夠的對比度的圖像，以顯示試樣的結(jié)構(gòu)有關(guān)的重要細(xì)節(jié)。

對比度改進(jìn)的另一個簡單的技術(shù)，涉及到選擇的安裝介質(zhì)，其折射率基本上不同試樣。例如，硅藻可被安裝在各種對比增強(qiáng)介質(zhì)，如空氣或商業(yè)介質(zhì)蘇合香。的折射率差提高對比度這些無色的樣本，并呈現(xiàn)其輪廓和標(biāo)記更加明顯。

各向異性材料通常表現(xiàn)出兩個或兩個以上的折射率，因此被稱為雙折射，或雙重折射。其中包括在這一類的標(biāo)本，礦物晶體（表現(xiàn)出高度的結(jié)構(gòu)對稱），纖維，毛發(fā)，及廣泛的其他生物標(biāo)本。當(dāng)光進(jìn)入光纖（光學(xué)軸的軸線以外）非軸的各向異性晶體，它被折射成兩條射線偏振光其振動方向彼此成直角定向，并以不同的速度。由此產(chǎn)生的光波的偏振，并能干擾顯微鏡分析儀中復(fù)合時產(chǎn)生雙折射的試樣是高度著色的，含有顯著量的造影圖像。

當(dāng)入射的光線照射不透明的表面，它被反映在具體的方式是該表面的地形。非常光滑的表面反射光線相等，這種機(jī)制被稱為鏡面反射的入射光的角度。表面不均勻或彌漫性往往反映在所有可能的角度通過漫反射進(jìn)入客觀的光量減少，導(dǎo)致這種現(xiàn)象稱為光。對比度在反射光顯微鏡，可以提高通過仔細(xì)試樣的制備。金相樣品往往顯示出晶粒邊界和/或拋光處理，以增加反射的光量進(jìn)入顯微鏡的反應(yīng)性液體和氣體腐蝕。污漬，熒光染料，薄膜，金屬涂層的形式，也可用于引入反射光顯微鏡標(biāo)本的對比度?？梢猿上耠p折射標(biāo)本，使用偏振反射光相和透明的對象通常使用的技術(shù)，如反射微分干涉對比度，暗場照明，和Hoffman調(diào)制對比度觀察的主題。

無論顯微鏡技術(shù)產(chǎn)生標(biāo)本的對比，的三個基本參數(shù)，以控制圖像質(zhì)量的分辨率，放大倍率，和對比度。在顯微鏡的主要功能是增加大小和解決分鐘試樣的詳細(xì)信息，但必須完成這一行為與足夠的對比度，以使檢測器（或傳統(tǒng)數(shù)字相機(jī)或人眼）可見試樣。