尼康顯微鏡：在光學(xué)顯微鏡上的創(chuàng)新

所有的科學(xué)工具，有可能沒有更多的思考和勞動(dòng)投入比光鏡下改善。它在過去的幾個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，推動(dòng)了科學(xué)家們希望較小，較暗，（圖1）和組織比以往任何時(shí)候都更深處的現(xiàn)象，觀察和測(cè)量。

今天的改進(jìn)的顯微鏡所產(chǎn)生的圖像的一個(gè)例子，提出如圖1所示，其示出了數(shù)字方式捕獲的多色一個(gè)Eclipse E600顯微鏡使用CFI60 40X的熒光物鏡和尼康的新的地塞米松1200數(shù)碼相機(jī)拍攝的組織培養(yǎng)細(xì)胞的熒光圖像。

一個(gè)世紀(jì)前，在顯微鏡達(dá)到光的性質(zhì)的經(jīng)典理論所預(yù)測(cè)的極限分辨率。然而，多分辨率需要允許實(shí)時(shí)顯微鏡檢查活細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)作。前在極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室做的最高的技術(shù)大師的技術(shù)，減少到現(xiàn)在的容易，臨床常規(guī)程序。認(rèn)真聽取顯微鏡，顯微鏡設(shè)計(jì)師，帶來了巨大的創(chuàng)新。本文總結(jié)了在顯微鏡設(shè)計(jì)的最新進(jìn)展，側(cè)重于最近開發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)可以提高科技進(jìn)步。

有限與無限光學(xué)系統(tǒng)

當(dāng)生物顯微鏡落射熒光和共聚焦技術(shù)相對(duì)簡單，之前的日子里，沒有什么必要的物鏡和目鏡 - 的interlens空間的之間夾著厚厚的光學(xué)元件。供應(yīng)的是標(biāo)準(zhǔn)的160 - 或170毫米的管長度，安裝法蘭的物鏡和座椅的目鏡之間的距離，以及此。這些工具有收斂光在interlens空間。冶金學(xué)家和地質(zhì)學(xué)家需要偏振光，及晶圓薄偏振片發(fā)明之前，這需要大量的棱鏡和其他配件，在這個(gè)空間中插入的。在20世紀(jì)30年代制造商之一，運(yùn)行的空間在標(biāo)準(zhǔn)管和困擾，由于棱鏡的像差校正的問題，第一次嘗試一個(gè)版本的無限遠(yuǎn)光學(xué)來解決這些麻煩。

術(shù)語“無窮大”是指物鏡被設(shè)計(jì)成投影圖像為無窮大，而不是一些有限的距離。無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)提供了客觀和目鏡之間的平行光區(qū)域。在這些系統(tǒng)中，復(fù)雜的光學(xué)組件可以被插入在該平行光的空間的情況下，引入光學(xué)像差或減少物鏡的自由工作距離。該系統(tǒng)還保留了物鏡的安排（圖2）的齊焦。圖2給出的是CFI60光學(xué)路徑的概念圖。無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)包括一個(gè)物鏡，管透鏡會(huì)聚的光束，和一個(gè)目鏡透鏡。模塊和組件可放置在創(chuàng)建了一個(gè)非常靈活的系統(tǒng)，無需額外的中繼光學(xué)系統(tǒng)的物鏡與鏡筒透鏡之間的光路平行。圖像點(diǎn)的位置保持不變，軸向和橫向，一樣的物鏡和管透鏡之間的對(duì)準(zhǔn)。

當(dāng)然，從無窮大型物鏡的光以形成圖像，我們可以看到或記錄，必須進(jìn)行再次收斂管透鏡，或第二個(gè)物鏡之間的平行光的空間和目鏡。一般，在一種情況下多達(dá)三個(gè)，主要的光學(xué)元件可以被放置在該空間不導(dǎo)致性能降低的情況下。

配件和插入組件的設(shè)計(jì)，現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)剛好1X的倍率，這是有價(jià)值的，當(dāng)具有相同的試樣比較的幾種光學(xué)技術(shù)。例如，當(dāng)光學(xué)落射熒光和微分干涉相差（DIC）的安裝，但仍是第三個(gè)設(shè)備的空間， - 用于與變倍，教學(xué)頭，一個(gè)多端口組件，用于兩個(gè)攝像機(jī)，或一個(gè)繪圖頭數(shù)字化墊跟蹤神經(jīng)元。

在古典顯微鏡年前，鏡頭設(shè)計(jì)者必須考慮的物鏡和目鏡校正鏡頭畸變，球形畸變和色差（縱向和橫向的），昏迷，散光和場(chǎng)曲的奢侈品。也被稱為橫向色差（LCA）的倍率色差 - 形成的紅色，綠色，和藍(lán)色的圖像在同一焦平面，但與形成不同大小的圖像的每種顏色。

傳統(tǒng)上，工作組已經(jīng)非常困難的糾正，往往留下未校正的物鏡，目鏡補(bǔ)償。該品種的光學(xué)眼鏡和計(jì)算技術(shù)可用年前不足以糾正LCA內(nèi)的物鏡任務(wù)。插入厚厚的組件在裸其中鏡頭束將進(jìn)一步破壞光學(xué)修正。

即使在今天，并不是所有的廠商已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了完全修正LCA內(nèi)的物鏡。由尼康公司（紐約州Melville）開發(fā)新的玻璃配方具有極低的色散，因此，所有的像差校正的物鏡本身內(nèi)。公司于1976年推出了第一款完全糾正CF（色差免費(fèi)）物鏡，這種新技術(shù)的不斷發(fā)展CFI60（無鉻無窮大，齊焦的肩膀高度60毫米）的物鏡，管鏡頭和目鏡（尼康）。與無限管長度設(shè)計(jì)的各種顯微鏡系統(tǒng)，僅這一項(xiàng)結(jié)合了其他必要的設(shè)計(jì)變更要充分利用這一概念。

新鏡頭

一個(gè)理想的物鏡為無邊顯微鏡系統(tǒng)的設(shè)計(jì)比通常的透鏡元件數(shù)量，需要更多的，由于緊急束必須聚焦于無限遠(yuǎn)處。添加到熒光技術(shù)的要求，如M-FISH（多色熒光原位雜交）（圖3），這是基于盡可能收集盡可能多的光子，并且要求更高的數(shù)值孔徑（NA）的透鏡。添加到這個(gè)高NA共聚焦技術(shù)的要求，長工作距離鏡頭遠(yuǎn)滲透到厚組織。為了滿足這些需求，今天的透鏡必須有較大的物理直徑的玻璃鏡片?？偠灾?，這些要求，使鏡頭過時(shí)的舊的尺寸標(biāo)準(zhǔn)。例如在圖3中，是一種多色熒光圖像的成纖維細(xì)胞，在電影拍攝的Eclipse E800顯微鏡使用CFI60 60X，NA 1.4油浸物鏡。

成立于19世紀(jì)中葉在英國皇家顯微學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的物鏡安裝螺紋的直徑。這個(gè)維度，而慷慨的時(shí)間和適當(dāng)?shù)呐f黃銅顯微鏡的光學(xué)設(shè)計(jì)上的限制，成為一個(gè)嚴(yán)重的。另外，前齊焦肩高的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) - 從檢體的客觀的安裝法蘭的距離 - 證明是不夠的目前的設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。這些尺寸的新標(biāo)準(zhǔn)（螺紋直徑25毫米和60毫米的齊焦的肩膀高度，尼康）可能使創(chuàng)新的新鏡頭，并確保有足夠的空間改善。管透鏡的焦距為200毫米，允許極長的工作距離與高NA的透鏡。這些新標(biāo)準(zhǔn)和管透鏡實(shí)現(xiàn)這些物鏡的工作距離。

CFI60鏡頭有更高的NAS比標(biāo)準(zhǔn)放大倍率，通?？商峁┑募?xì)節(jié)更高的分辨率，更大的聚光能力，在共聚焦應(yīng)用和高性能。許多Eclipse的儀器物鏡共享的屬性不再比平常的工作距離。這允許從頂部到底部，而不必?fù)?dān)心，打破玻璃蓋或損壞的物鏡本身要聚焦厚的樣品。應(yīng)用浸油更容易，因?yàn)槭遣粩嘧兓脑嚇?。厚底室是可用的，顯微高倍率的鏡頭成為可能。

現(xiàn)在露出的內(nèi)部機(jī)制和動(dòng)態(tài)活性細(xì)胞的研究，每一個(gè)光子熒光發(fā)射是寶貴的。收集這些以最大的效率，需要盡可能高的數(shù)值孔徑的物鏡。福陸公司平場(chǎng)40X NA 1.30油浸鏡頭結(jié)合的放大倍率，高NA，現(xiàn)場(chǎng)平整度，工作距離長，高紫外透射熒光研究高效的工作優(yōu)化。對(duì)于相等的放大倍率，圖像的亮度在落射照明系統(tǒng)的透鏡的數(shù)值孔徑的四次方成正比。計(jì)算表明，在比較普通的干鏡頭40X浸沒透鏡1.30 0.65 NA NA，得到亮度增加16倍。

更好的干圖片

很多的觀測(cè)都是用普通，非油浸 40X的物鏡，所謂的干鏡頭。在這種程度的放大，客觀上需要一個(gè)相當(dāng)高的NA，提供豐富的細(xì)節(jié)，40X放大倍率應(yīng)揭示。NA最低的通常為40X鏡頭是0.65。即使在此NA，在顯微鏡的光學(xué)性能變得依賴于一個(gè)光學(xué)部件的透鏡設(shè)計(jì)和制造商無法控制 - 試樣上的蓋玻片。顯微鏡制造商推薦的蓋玻片的厚度為0.17mm，并且對(duì)身體的物鏡（這對(duì)應(yīng)于＃1 1/2的蓋玻片上，在實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)房屋的條款）雕刻。

許多試樣制備與其它厚度的蓋玻片。這是觀測(cè)在低功率的影響甚微，但在40X以上，它具有強(qiáng)大的影響力。在鏡頭設(shè)計(jì)師條款，非標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片打亂客觀的球面像差，從用戶的角度，圖像失去對(duì)比度和看起來渾濁。

雖然0.65是普通的40X鏡頭的NA，性能更高的干物鏡可高達(dá)0.95。這些不利影響蓋玻片厚度校正套環(huán)上必須有物鏡。優(yōu)化圖像質(zhì)量，將其同時(shí)觀察圖像的外觀。車削領(lǐng)子的物鏡的一些組件，不幸的是，也更改了有效的鏡頭的焦距改變的內(nèi)部間隔。在實(shí)踐中，必須同時(shí)用一只手和精細(xì)的對(duì)焦旋鈕，與其他的衣領(lǐng)，一邊尋找清晰的圖像。許多用戶從來沒有掌握這種技術(shù)。高數(shù)值孔徑，高干燥鏡頭（尼康），大大減少了**設(shè)計(jì)的焦點(diǎn)偏移，從而更容易優(yōu)化的圖像質(zhì)量。對(duì)于NAS高于0.95，浸泡鏡片提供。

通用物鏡

每個(gè)制造商列出其他觀測(cè)技術(shù)，比普通明場(chǎng) - 相襯，DIC和熒光技術(shù)，如不同的特殊物鏡。研究人員使用多種技術(shù)，一旦需要購買一些這些物鏡對(duì)于任何給定的倍率。到現(xiàn)在為止，這是不可能的性能沒有顯著的損失，這四個(gè)物鏡設(shè)計(jì)一個(gè)物鏡。平場(chǎng)氟DLL鏡頭（尼康）在所有這些模式的四個(gè)功能，而不會(huì)犧牲圖像質(zhì)量。為節(jié)省錢，便利和物鏡轉(zhuǎn)換器上的空間

最低倍率的物鏡

在生活中，我們通常觀察概述第一場(chǎng)景，然后放大的細(xì)節(jié)，抓住我們的眼球。在顯微鏡下，我們先低權(quán)力開始，然后移動(dòng)到更高的權(quán)力。病理學(xué)家，神經(jīng)，和植物學(xué)家在眾多的生命科學(xué)專業(yè)人士常常依賴于低倍率的方向和字面意思是“大局”。然而，在許多顯微鏡，最低的功耗，使用10X的物鏡和10X目鏡是100X，自然大小相當(dāng)?shù)娘w躍。由于顯微鏡往往不愿意改變低倍率目鏡，低倍率的物鏡是較低級(jí)別的放大倍率的最佳選擇。

隨著的CFI60 0.5X物鏡，用戶可以在很寬的視野觀察和拍攝。與實(shí)際的字段為50毫米的觀點(diǎn)，這一物鏡是有用的宏觀觀察大的樣品，如椴干圖4中所示的薄膜部。常規(guī)的無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)相比，所提供的物鏡的圖像區(qū)域的大小大五倍以上。實(shí)際尺寸拍攝有可能在35毫米膠片。

各大廠商紛紛提供約物鏡。4X，2X，和甚至1X權(quán)力。該CFI Macroplan 0.5X物鏡，有其特殊的配件，呈現(xiàn)在目鏡5X圖像，將拍攝自然的尺寸，1X的35毫米膠卷上的圖像（參見圖4）。該鏡頭提供了一個(gè)非常高的水平，細(xì)節(jié)和色彩校正，使顯微鏡放大倍率范圍最廣。

符合人體工程學(xué)的設(shè)計(jì)

不僅僅是光學(xué)顯微鏡是多，它是實(shí)驗(yàn)室的儀器科學(xué)家有身體接觸。當(dāng)購買的儀器，其中一個(gè)可能會(huì)坐幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，這是非常重要的考慮身體的舒適。這是不能輕易表達(dá)的一個(gè)規(guī)格表。它必須經(jīng)歷的第一手資料。

在許多舊顯微鏡（甚至在一些較近期的），各種控件放置在他們最方便的制造商。這有時(shí)會(huì)造成尷尬或不便。

所有主要制造商已在其展臺(tái)設(shè)計(jì)結(jié)合人體工程學(xué)考慮，但Eclipse的工具帶來符合人體工程學(xué)的考慮到一個(gè)更高的水平。廣泛的研究用戶如何坐在他們的儀器，測(cè)量方便深遠(yuǎn)的距離，舒適的手臂和頭部位置的確定被認(rèn)為是在設(shè)計(jì)。舞臺(tái)上的位置的處理和聚焦控制旋鈕E800顯微鏡進(jìn)行比較與常規(guī)顯微鏡在圖5（a）。保持自然的位置，并具有身體等距雙手，應(yīng)變減輕。此外，載物臺(tái)手柄和微調(diào)旋鈕的位置，這樣他們可以用一只手進(jìn)行操作，提高舒適的觀察。直立和傾斜目鏡管可在許多尼康顯微鏡（圖5（b）），以確保檢查效率提高和駕駛舒適性增強(qiáng)，通過使用一個(gè)系統(tǒng)在一個(gè)自然的位置。

此外，加入的組件的interlens空間并不總是舒適的完成。如果組件只是堆疊，大多數(shù)廠家一樣，雙目觀察頭，他們上的目鏡，其結(jié)果往往是一個(gè)令人不安的高收視安排，用戶吊裝他們的脖子上，同行通過目鏡。在Eclipse，最多三個(gè)組件插入在其中鏡頭空間的，而不需要改變儀器的常數(shù)，方便的眼睛的位置。

在新的臺(tái)燈，使用最頻繁的控制的顯微鏡中最方便的地方，無論便于制造。凡一起使用的控制與對(duì)方，如階段的運(yùn)動(dòng)和精細(xì)的焦點(diǎn)，在那里他們可以用同一只手的手指進(jìn)行調(diào)整。隨著桌面上舒適地休息的前臂，最常用的控制自然垂下的指尖下。低得多的舞臺(tái)位置，使滑動(dòng)改變方便。可以安裝在任何一方左手或右手操作階段控制。

進(jìn)入看臺(tái)，新設(shè)計(jì)的其它性能包括時(shí)間和熱穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，這是重要的，隨著時(shí)間的推移，這種有絲分裂的研究與胚胎調(diào)查延伸。振動(dòng)阻尼也增加，以改善捕獲的圖像的分辨率。

結(jié)論

最終光學(xué)顯微鏡被創(chuàng)建，雖然市場(chǎng)上帶來了新的工具顯微鏡到高的發(fā)展水平，我們可能永遠(yuǎn)不會(huì)達(dá)到這個(gè)物鏡，只要繼續(xù)科研。未來的需求將需要?jiǎng)?chuàng)新，我們還不能預(yù)見。但是，今天的最好的儀器為用戶提供得多可能比短短幾年前的性能和多功能性。