奧林巴斯顯微鏡：熒光激發(fā)和發(fā)射基本面概述

由于其新穎的電子配置，熒光染料有獨特的特征吸收光譜（通常是類似的激發(fā)）和發(fā)射。這些吸收光譜和發(fā)射光譜表明相對強(qiáng)度的熒光，與經(jīng)典的相對強(qiáng)度與波長在橫軸上繪制在垂直軸。對于一個給定的熒光染料，制造商指示的照明激發(fā)光強(qiáng)度和熒光的發(fā)光強(qiáng)度的峰值波長為峰值波長。重要的是要了解顯示對于一個給定的熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜的圖表和曲線的原點。

為了確定一個特定的熒光染料的最大吸收波長（通常是相同的激發(fā)最大值）的發(fā)射光譜來確定，并在該波長下被激發(fā)的熒光。一個典型的熒光染料的吸收光譜示出在圖1（a）如吸收的相對強(qiáng)度對測得的波長作圖。甲單色儀（一種裝置，允許通過的窄頻帶的光的波長），然后用于掃描的熒光發(fā)射強(qiáng)度，發(fā)射波長在整個系列。熒光的相對強(qiáng)度的測量是在不同波長繪制的發(fā)射光譜，圖1（b）中示出。以相似的方式確定一個給定的熒光染料的激發(fā)光譜的最大強(qiáng)度的波長，而通過一組連續(xù)的波長激發(fā)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射通過監(jiān)測。其最大發(fā)射選擇，唯一的排放物在該波長的光傳遞給探測器。激發(fā)誘導(dǎo)（通常是通過單色儀），在不同的激發(fā)波長所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度作為波長的函數(shù)的測量。其結(jié)果是一個圖形或曲線（圖1（a）中示出），示出在光譜的激發(fā)波長的激發(fā)所產(chǎn)生的相對熒光強(qiáng)度。

以下幾點結(jié)論：可以從一個典型的曲線或光譜的激發(fā)波長和發(fā)射集。通常有較高的波長的激發(fā)光譜和結(jié)束的下的發(fā)射光譜的波長端之間的重疊。必須消除這種重疊激發(fā)和發(fā)射強(qiáng)度和波長（圖1（c）中示出），在熒光顯微鏡中，激發(fā)光濾光片，二色光束分離器（在反射光中的熒光）的適當(dāng)選擇，通過阻擋或發(fā)射過濾。否則，激發(fā)光更亮淹沒弱熒光發(fā)射光，并大大減少了標(biāo)本的對比。

當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)（見下面一節(jié)題為“ 分子解釋），有一個振動能量損失。其結(jié)果是，被移動到更長的波長比激發(fā)光譜（波長成反比的輻射能量）的發(fā)射光譜。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯“或斯托克斯位移。斯托克斯位移（Stokes shift）越大，越容易分開激勵光從發(fā)射光。的發(fā)光強(qiáng)度的峰值通常是低于激發(fā)峰，發(fā)射曲線的往往是激發(fā)曲線的鏡像圖像，但轉(zhuǎn)移到更長的波長。為了實現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度，熒光染料通常是在該波長激發(fā)激發(fā)曲線的峰值，選擇在發(fā)射曲線的峰值波長（或觀察者所選擇的其它波長的光）的發(fā)光檢測。的激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇控制的適當(dāng)?shù)倪^濾器。在確定的光學(xué)系統(tǒng)的光譜響應(yīng)，技術(shù)修改需要考慮到對于不同波長的玻璃傳輸和檢測器的靈敏度變量等因素。

在圖2中示出一個典型的熒光染料吸收的發(fā)光光譜圖。請注意，這個典型的熒光吸收（通常是相似的純化合物的激發(fā)曲線）和發(fā)射熒光強(qiáng)度的曲線形狀有幾分相似。一直被稱為十九世紀(jì)中期以來，（Stokes定律）之間的激發(fā)和發(fā)射波長移位。另外請注意，激發(fā)和發(fā)射曲線的上端處的激發(fā)和發(fā)射曲線的較低的波長有所重疊。

激發(fā)和發(fā)射波長的分離是通過選擇適當(dāng)?shù)倪^濾器，如在圖3中以阻止或通過特定波長的光譜。熒光照明器的設(shè)計是基于容易地更換過濾器插入到光路的方式向試樣的激發(fā)光和發(fā)射光的控制，然后由試樣放出。中的發(fā)光強(qiáng)度低，這是很重要的，選擇的激發(fā)光源是足夠的亮度，因此，可以最大化的發(fā)光相對較弱的，令人滿意的吸收和生物產(chǎn)量，熒光染料的選擇。

被稱為消光系數(shù)的熒光染料吸收的激發(fā)光的效率的。消光系數(shù)越大，在一個給定的波長區(qū)域（隨后的熒光發(fā)射的一個先決條件）的光吸收的可能性就越大。發(fā)射的光的產(chǎn)率被稱為量子數(shù)之比（“數(shù)據(jù)包”的能量）的量子產(chǎn)率，發(fā)射量子吸收（通常產(chǎn)率是0.1和0.9之間）的數(shù)量相比。低于1的量子產(chǎn)率是能量的損失通過非輻射途徑（如熱或光化學(xué)反應(yīng)），而不是重新輻射通路的熒光的結(jié)果。在表1下面列出的一組選定的熒光染料的熒光量子產(chǎn)率。請注意，一些量子產(chǎn)率似乎微不足道（苯），而別人是非常有效的（熒光素和羅丹明-B）。

熒光的熒光量子產(chǎn)率

表1

消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，平均的光源的發(fā)光強(qiáng)度，熒光壽命的熒光發(fā)射的強(qiáng)度和實用程序的所有重要因素。此外，局部地區(qū)的環(huán)境周圍的熒光染料中起著極其重要的作用，在確定的熒光發(fā)射的特征。溶劑的粘度，離子濃度，pH值，和疏水性環(huán)境中的變量，如可以有深遠(yuǎn)的影響的熒光強(qiáng)度和激發(fā)態(tài)的壽命。

熒光分子解釋

圖解方式示于圖4（a）（稱為雅布隆斯基能量圖），有時被描述熒光活性。激發(fā)之前，被描述為在基態(tài)的分子的電子組態(tài)。吸收的激發(fā)光的光子，通常短的波長時，電子可以被提高到一個更高的能量和振動激發(fā)態(tài)，一個過程，可能只需要一千萬億分之一的第二期間（時間段通常被稱為飛秒，10E 15秒）。

熒光，期間間隔約一萬億第二（一皮秒或10E-12秒），被激發(fā)的電子可能會失去一些振動能量對周圍環(huán)境和返回到了什么叫做最低激發(fā)單重態(tài)。從最低激發(fā)單重態(tài)的電子是“放松”返回到基態(tài)時，如在圖4中示出與同時發(fā)射的熒光光（一）。所發(fā)射的光總是比波長較長的激發(fā)光（斯托克斯定律）和繼續(xù)，只要激發(fā)照明沐浴熒光試樣。如果被中止，令人興奮的輻射熒光停止。

有時候被激發(fā)的電子，而不是的放松的最低單重態(tài)，可通過振動相互作用，使一個禁戒躍遷到退出的三重態(tài)，然后到基態(tài)的過程中，輻射的發(fā)射可能大大延遲幾秒鐘，或以上。這種現(xiàn)象是磷光特性，圖4（b）所示。在某些情況下，被激發(fā)的電子可以從三重態(tài)的最低激發(fā)單重態(tài)，然后返回到基態(tài)，隨后發(fā)出熒光。這個動作需要較長的時間比平常熒光（約一兩微秒），被稱為延遲熒光（圖4（c））。在其他情況下（例如，光漂白或鹽，重金屬或其他化學(xué)品的存在下），發(fā)出的光可能會被顯著減少或完全停止，如下文所述。

衰退或漂白

有一些特定的條件下可能影響再輻射的光激發(fā)熒光，從而降低熒光強(qiáng)度。這種減少的發(fā)光強(qiáng)度通常被稱為衰退或漂白。一些學(xué)者進(jìn)一步細(xì)分變?yōu)?/span>淬滅和漂白。漂白的熒光分子，因為在分子氧存在下的光強(qiáng)度是不可逆的分解。淬滅也導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的減少和經(jīng)常作為氧化劑或重金屬或鹵素化合物的鹽的存在下的結(jié)果帶來的。

通常情況下，淬滅結(jié)果的能量轉(zhuǎn)移到其他受體分子物理激發(fā)熒光基團(tuán)，這種現(xiàn)象被稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這種特殊的現(xiàn)象已成為一個較新的技術(shù)，測量距離遠(yuǎn)低于在光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率的基礎(chǔ)。

漂白的發(fā)生，導(dǎo)致FRAP，恢復(fù)或熒光漂白后，被稱為一種技術(shù)。FRAP是基于激光短脈沖串和隨后的恢復(fù)引起的擴(kuò)散到漂白區(qū)域的熒光基團(tuán)的熒光觀察漂白。

熱門抗淬滅試劑的屬性

表2

為了減少在某些試樣的衰退程度，它可能是在光路中，最好使用中性密度過濾器之前的照明達(dá)到激發(fā)光濾光片，從而減少激發(fā)光的強(qiáng)度。在其他情況下，可能會降低衰落的影響，通過改變安裝介質(zhì)的pH值，或通過使用抗漂白劑（表2中列出了一些比較重要的代理）。對于數(shù)字成像，顯微攝影，或簡單地目視觀察，迅速變化的視場也可避免衰退效果。