奧林巴斯顯微鏡：熒光的基本概念

熒光是敏感，其中創(chuàng)建的物理（例如，光的吸收），機(jī)械（摩擦），或化學(xué)機(jī)制從電子激發(fā)態(tài)的分子發(fā)光的無處不在的發(fā)光過程家族的成員。通過由紫外線或可見光的光子的分子的激發(fā)發(fā)光發(fā)電的是這樣一種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，正式分為兩大類，熒光和磷光，這取決于激發(fā)態(tài)的電子組態(tài)和排放路徑。熒光是一些原子和分子的屬性，在一個特定的波長吸收光，并隨后經(jīng)過短暫的時間間隔更長的波長的光發(fā)射被稱為熒光壽命。發(fā)生的方法的磷光熒光的方式類似，但是具有更長的激發(fā)態(tài)壽命。

熒光的過程是由三個重要的活動，所有這些由幾個數(shù)量級的（見表1），分離的時間尺度上發(fā)生。激發(fā)的易感分子由一個傳入的光子發(fā)生在飛秒（10E-15秒），而最低能量級別的激發(fā)態(tài)電子振動弛豫是慢得多，并且可以測量在皮秒（10E-12秒）。最終的過程中，發(fā)射的較長波長的光子，并返回到基態(tài)的分子，納秒（10E-9秒），在相對長的時間內(nèi)發(fā)生。雖然整個分子的熒光壽命，激發(fā)排放，僅在十億分之一秒，這種現(xiàn)象是一個驚人的表現(xiàn)，光與物質(zhì)之間的相互作用形成的基礎(chǔ)，廣闊的領(lǐng)域的穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜儀和顯微鏡。由于極大地敏感排放概況，空間分辨率和高特異性的熒光調(diào)查，該技術(shù)正迅速成為遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的重要工具。

一些調(diào)查報告在十七和十八世紀(jì)的發(fā)光現(xiàn)象，但它是英國科學(xué)家喬治爵士G.斯托克斯熒光誰首先介紹于1852年，是負(fù)責(zé)鑄造項(xiàng)榮譽(yù)的藍(lán)白色熒光的礦物熒光（氟石）。斯托克斯還發(fā)現(xiàn)發(fā)射光譜的波長漂移到更大的值，他的名字命名。在二十世紀(jì)早期的一部分，由幾個著名的科學(xué)家，其中包括8月克勒和卡爾·賴克特，最初報道的熒光是一個討厭鬼，在紫外線顯微鏡的光學(xué)顯微鏡熒光第一次遇到。第一熒光顯微鏡由德國物理學(xué)家奧托·Heimst?dt和海因里?！とR曼在1911年和1913年之間，作為一個分拆上市的紫外線儀器。這些顯微鏡觀察到細(xì)菌，動物和植物組織的自體熒光。此后不久，斯坦尼斯拉夫·馮·Provazek推出了一個新的時代，當(dāng)他用熒光顯微鏡來研究固定的組織和活細(xì)胞中的染料結(jié)合。然而，直到20世紀(jì)40年代初，阿爾貝浣熊開發(fā)出一種技術(shù)，用熒光染料標(biāo)記抗體，從而造就了免疫領(lǐng)域的。到二十一世紀(jì)之交的，本場熒光顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的一場革命，負(fù)責(zé)特定的多個標(biāo)簽的單個細(xì)胞器和大分子復(fù)合物合成和基因編碼的熒光探針耦合的力量，活細(xì)胞成像。

熒光過程的時間尺度范圍內(nèi)

表1

熒光一般是與高度共軛的多環(huán)芳香族存在在幾個能量水平在地面狀態(tài)下，每一個與一個特定的安排的電子的分子軌道中任一項(xiàng)的分子研究。一個分子的負(fù)電荷的分布和整體分子的幾何形狀確定的電子狀態(tài)。對于任何特定的分子中，存在幾個不同的電子態(tài)（在圖1中示出為S（O） ，S（1） ，S（2） ），根據(jù)總的電子能量和各種電子自旋態(tài)的對稱性。的每一個電子的狀態(tài)被進(jìn)一步細(xì)分成若干與原子核和成鍵軌道的振動和轉(zhuǎn)動能級。對于大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)電子單中的所有電子的自旋配對（有相反的旋轉(zhuǎn)）。在室溫下，極少數(shù)分子存在于任何其他國家比基態(tài)的最低振動能級，從而有足夠的內(nèi)部能量，激發(fā)過程通常來自這個能量水平。

類分子能夠發(fā)生電子躍遷，最終結(jié)果是已知的作為熒光探針，熒光染料，或僅僅染料熒光。熒光染料的共軛到一個更大的大分子（如核酸，脂質(zhì)，酶，或蛋白質(zhì)），通過吸附或共價鍵被稱為熒光團(tuán)。在一般情況下，熒光團(tuán)被分成兩大類，稱為內(nèi)在的和外在的。內(nèi)在的熒光基團(tuán)，如芳族氨基酸，神經(jīng)傳遞素，卟啉，和綠色熒光蛋白，是那些自然發(fā)生。外源性熒光基團(tuán)是人工合成的染料或修改的生化物質(zhì)被添加到一個樣本具有特定的光譜特性產(chǎn)生熒光。

吸收，激勵和排放

發(fā)生在不同的分子軌道激發(fā)態(tài)之間的間隔緊密的振動和轉(zhuǎn)動能級的熒光染料吸收的能量。有古典的雅布隆斯基能量圖（見圖1），命名榮譽(yù)的波蘭物理學(xué)教授亞歷山大·雅布隆斯基的各種能量水平參與的吸收和發(fā)射光的熒光。一個典型的雅布隆斯基圖示出的單峰接地（S（0） ）的狀態(tài)，以及第一（S（1） ）和第二（S（2） ）的激發(fā)單重態(tài)的水平線作 為堆棧。在圖1中，較厚的線表示電子的能量水平，而較薄的線表示的各種振動的能量狀態(tài)（旋轉(zhuǎn)能量狀態(tài)將被忽略）。作為直鏈或波浪形箭頭所示狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，取決于是否吸收或發(fā)射的光子（直箭頭）或查詢結(jié)果，從分子的內(nèi)部轉(zhuǎn)換或非輻射弛豫過程（波狀箭頭）與過渡。垂直向上箭頭用來表示的瞬時性激發(fā)過程，同時保留更長的時間尺度上發(fā)生的這些事件的波浪形箭頭。

吸收的光的發(fā)生非常迅速（約飛秒，所必需的時間為旅行單一波長的光子）在離散量稱為量子和對應(yīng)于從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的熒光激發(fā)。同樣地，通過熒光或磷光發(fā)射的光子在量子方面也被測量。量子中的能量（普朗克法）由以下方程表示：

E =hν =HC /λ

其中 ，E 是能量，h是普朗克常數(shù)，ν和λ是入射光子的頻率和波長的， 和 c 是光的速度。普朗克定律決定的吸收的光子的輻射能量成正比的頻率和波長成反比，即入射的波長較短具有更大的量子能量。的吸收一個光子的能量，它的發(fā)生是由于振蕩與分子中的電荷（電子）的光波的電場矢量的相互作用，由熒光團(tuán)是一個全或無的現(xiàn)象，并且可以只發(fā)生與入射光特定波長的吸收帶。如果被吸收的光子包含更多的能量比為一個簡單的電子躍遷是必要的，多余的能量通常被轉(zhuǎn)換成振動和轉(zhuǎn)動能量。然而，如果之間碰撞發(fā)生的分子和一個光子具有足夠的能量，以促進(jìn)過渡，不發(fā)生吸收。譜寬的吸收帶產(chǎn)生緊密間隔的振動能量水平加上熱運(yùn)動，使一個范圍的光子能量，以符合特定的過渡。由于激發(fā)的分子通過吸收通常發(fā)生在電子自旋配對而不改變，激發(fā)態(tài)也是一個單峰。在一般情況下，熒光調(diào)查工作是在輻射具有波長范圍從紫外到的電磁波譜的可見光區(qū)域（250?700納米）。

使用紫外線或可見光，常見的熒光團(tuán)通常是興奮較高振動能級（S（1） ）的第一或第二（S（2） ）的單峰的能量狀態(tài)。之一的吸收（或激勵）的轉(zhuǎn)換示于圖1（左手綠色箭頭）的發(fā)生，從最低的基態(tài)的振動能級更高的振動水平的第二激發(fā)態(tài)（過渡記為S（O） = 0?S（2） = 3）。第二激勵過渡描繪從第二級的振動的基態(tài)的第一激發(fā)態(tài)的最高的振動水平（表示為S（0） = 1 ?S（1）= 5）。在一個典型的熒光基團(tuán)，具有寬的光譜的波長的照射會產(chǎn)生允許的躍遷，填充的各種振動的激發(fā)態(tài)的能級的整個范圍。一些這些過渡將具有高得多的程度的概率比其他人，并相結(jié)合時，將構(gòu)成該分子的吸收光譜。請注意，對于大多數(shù)熒光，吸收光譜和激發(fā)光譜是不同的，但往往重疊，有時可能會變得難以區(qū)分。在其他情況下（例如熒光素，）的吸收光譜和激發(fā)光譜清楚地隔開。

緊隨吸收一個光子，幾個進(jìn)程將發(fā)生的不同的概率，但最有可能將是最低的振動能量的第一激發(fā)態(tài)（S（1）= 0，圖1）的水平的放寬。這個過程被稱為作為內(nèi)部轉(zhuǎn)換或振動弛豫（光發(fā)射的情況下的能量損失），一般發(fā)生在一皮秒或更少。因?yàn)檎舭l(fā)過程中激發(fā)態(tài)的壽命顯著的振動周期，分子幾乎總是進(jìn)行完整的振動弛豫在他們興奮的壽命。過量的振動能量被轉(zhuǎn)換成熱量，該熱量被吸收由相鄰的溶劑分子碰撞的激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)時。

期間納秒（時間最長的時期，在熒光過程由幾個數(shù)量級）的順序，最后才放寬到基態(tài)的激發(fā)態(tài)分子中存在的最低激發(fā)單重態(tài)（S（1） ）。如果從這個長期存在的狀態(tài)是伴隨著放松發(fā)射一個光子，這個過程是正式稱為熒光。緊密排列的振動能級的基態(tài)，再加上正常的熱運(yùn)動時，在發(fā)射的光子能量，產(chǎn)生廣泛。其結(jié)果，通常觀察到熒光發(fā)光強(qiáng)度以上的頻帶的波長，而不是一個清晰的線。大多數(shù)熒光基團(tuán)可以成千上萬次重復(fù)的激發(fā)和發(fā)射周期數(shù)以百計(jì)的高反應(yīng)性的激發(fā)態(tài)的分子是光致漂白之前，導(dǎo)致銷毀熒光。例如，充分研究的探針的熒光素異硫氰酸酯（FITC）可以為約30,000個周期前的分子不再響應(yīng)入射照明光進(jìn)行激發(fā)和放松。

其他幾個弛豫途徑有不同程度的概率與熒光發(fā)射過程競爭。非輻射激發(fā)態(tài)能量可以消散熱量（由青色波狀圖1中箭頭所示），激發(fā)熒光團(tuán)可以與另一分子碰撞，來傳遞能量的非輻射過程中的第二類型（例如，猝滅，如所指示的紫色波浪箭頭在圖1中），或者被稱為系統(tǒng)間跨越的最低激發(fā)三重態(tài)能發(fā)生（在圖1中的藍(lán)色的波浪形箭頭）的現(xiàn)象。后一種情況是比較少見的，但最終的結(jié)果無論是在發(fā)射的光子通過磷光或產(chǎn)生延遲熒光的激發(fā)單重態(tài)的過渡。禁止來自三重激發(fā)狀態(tài)的轉(zhuǎn)換到單線基態(tài)，這會導(dǎo)致在三重態(tài)發(fā)光的幾個數(shù)量級低于用于熒光的速率常數(shù)。

三重態(tài)躍遷圖解雅布隆斯基能量輪廓上的右手側(cè)在圖1中示出。間竄越低概率發(fā)生的事實(shí)，分子必須先經(jīng)過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換未成對電子，不利的過程。三重態(tài)的基本重要性是所表現(xiàn)出分子在該狀態(tài)下，其結(jié)果往往是在漂白和生產(chǎn)造成的損害的自由基的化學(xué)反應(yīng)性的高度。在生物樣本中，溶解的氧是一種非常有效的在三重態(tài)的熒光的猝滅劑。這通常是一個三重的基態(tài)氧分子，可以激發(fā)單重態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致的反應(yīng)，漂白劑，熒光或具有活細(xì)胞光毒性影響。三重態(tài)的熒光基團(tuán)中也可以直接與其它生物分子的反應(yīng)，通常在這兩個物種的失活所導(dǎo)致。分子中含有重原子，如鹵素和許多過渡金屬，通常方便系間竄越經(jīng)常磷光。

從基態(tài)（S（0） ）發(fā)生的激發(fā)單重態(tài)（S（1） ）的過渡的概率取決于一個電子時，駐留在與那些的接地狀態(tài)對之間的相似程度的振動和轉(zhuǎn)動的能量狀態(tài)目前處于興奮狀態(tài)，圖2中列出的。圖2中示出的Franck-Condon能量圖呈現(xiàn)的振動能量的概率分布之間的各級在地面（S（0） ）和第一激發(fā)（ S （1） ）指出針對一種假設(shè)的分子。激發(fā)從地面到激發(fā)態(tài)的躍遷（紅色線）發(fā)生在這樣一個短的時間內(nèi)（飛秒）的核間的距離與成鍵軌道不具有足夠的時間來改變，從而轉(zhuǎn)換被表示為垂直線。這個概念被稱為“ 弗蘭克-康登原理。的最大吸收波長（紅色線在中心）表示的最可能的核間距在基態(tài)到允許的振動能級處于興奮狀態(tài)。

在室溫下，是不足夠的熱能，顯著填充興奮的能量狀態(tài)和最有可能的電子狀態(tài)是基態(tài)（S（O） ），其中包含了一些不同的振動能量狀態(tài)，每個不同的能量水平。最被看好的過渡將是那些最大限度的轉(zhuǎn)動和振動的電子密度概率重疊的基態(tài)和激發(fā)態(tài)（見圖2）。然而，不同波長（與量子）的入射的光子可以具有足夠的能量，以被吸收，并常常產(chǎn)生來自其他核間的分離距離和振動能級轉(zhuǎn)換。這種效應(yīng)引起到包含多個峰（圖3）的吸收光譜。廣泛的光子能量與吸收轉(zhuǎn)換熒光基團(tuán)，使產(chǎn)生的光譜顯示為寬波段，而不是離散線。

假設(shè)的在圖3中示出的吸收光譜（藍(lán)波段）的查詢結(jié)果從幾個偏愛的電子從基態(tài)躍遷至激發(fā)的最低能量狀態(tài)（標(biāo)記為S（O） ，S（1） ，分別）。的吸收光譜是疊加在垂直線（黃色）代表從在基態(tài)的最低振動能級轉(zhuǎn)換到較高的振動能級處于興奮狀態(tài)。需要注意的是過渡到最高的振動激發(fā)水平是那些發(fā)生在較高的光子能量（低級波長或更高的波數(shù)）。沿著上圖3的橫軸表示在電子伏特（eV）與轉(zhuǎn)換相關(guān)的近似能量。還包括與態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能級沿右側(cè)縱坐標(biāo)。

通過熒光團(tuán)的吸收光譜的掃描，同時記錄在一個單一的波長（通常為最大發(fā)射光強(qiáng)度的波長）的發(fā)光強(qiáng)度，將產(chǎn)生的激發(fā)光譜。同樣，令人興奮的在單一波長（再次，優(yōu)選的最大吸收波長）的熒光團(tuán)，而通過掃描的發(fā)射波長將揭示的發(fā)光光譜的更新?？杀灰暈楦怕史植己瘮?shù)給定的量子能量的光子將被吸收，并最終使熒光團(tuán)發(fā)射的熒光輻射的形式的第二光子激發(fā)和發(fā)射光譜。

Stokes位移和鏡像規(guī)則

如果仔細(xì)審核的熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光譜，幾個重要的特點(diǎn)變得顯而易見。作為快速的內(nèi)部轉(zhuǎn)換的結(jié)果，從較高的初始的S（1）激發(fā)態(tài)的最低振動能級的激發(fā)態(tài)的激發(fā)能量（波長）的發(fā)光光譜是獨(dú)立的。對于許多常見的熒光基團(tuán)的振動能級間距是相似的基態(tài)和激發(fā)態(tài)，從而導(dǎo)致的熒光光譜的吸收光譜，外觀極像的鏡像。這是由于這樣的事實(shí)，相同的轉(zhuǎn)換是最有利的吸收和發(fā)射。最后，在溶液中（如熒光團(tuán)一般研究）的詳細(xì)的振動結(jié)構(gòu)一般是丟失，顯示為一個寬峰的發(fā)射光譜。

如前所述，光子吸收后，激發(fā)熒光團(tuán)將迅速進(jìn)行松弛到最低的振動能量的激發(fā)態(tài)。這種快速的內(nèi)部轉(zhuǎn)換的一個重要后果是，所有后續(xù)的繼續(xù)從最低級的振動激發(fā)態(tài)（S（1） ）的的放松途徑（熒光，無輻射弛豫，間竄躍等）。具有吸收，激發(fā)態(tài)的電子在將返回一個特定的振動的能量水平在地面狀態(tài)的概率是正比于在各自的狀態(tài)（圖2）之間的能量水平的重疊。返回到基態(tài)（S（O） ），通常會出現(xiàn)更高的振動水平（參見圖3），其后達(dá)到熱平衡（振動弛豫）的過渡。因?yàn)榘l(fā)射一個光子經(jīng)常離開更高的振動的基態(tài)中的熒光基團(tuán)，發(fā)射光譜是典型的吸收光譜得到的從地面到第一激發(fā)態(tài)的過渡的鏡像圖像。效果，返回到一個特定的在地面狀態(tài)的振動能級的電子的概率是類似的，電子的激發(fā)前的狀態(tài)中的地面位置的概率。被稱為鏡像規(guī)則，則說明這個概念，在圖3的排放轉(zhuǎn)換（藍(lán)線）從最低振動能級的激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的各種振動水平。將得到的發(fā)射光譜（紅色條帶）是顯示由假想的生色團(tuán)的吸收光譜的鏡像圖像。

在許多情況下，由高能量光子激發(fā)導(dǎo)致較高的電子和振動水平（S（2） ，S（3） ，等），從而迅速失去多余的能量，作為熒光團(tuán)放松的最低振動能級的人口第一激發(fā)態(tài)（見圖1）。由于這種快速弛豫過程，發(fā)射光譜通常是獨(dú)立的激發(fā)波長（一些熒光團(tuán)發(fā)射從更高的能量狀態(tài)，但這種活性是罕見的）。出于這個原因，發(fā)射是最低激發(fā)態(tài)躍遷的接地狀態(tài)，但是不是整個的吸收光譜，其中可能包括轉(zhuǎn)換到較高的能量水平的鏡像。鏡像規(guī)則的一個極好的測試是檢查中的線性圖的波數(shù)（波長或在每厘米的波的數(shù)目的倒數(shù)），這是直接正比于頻率和量子能量的吸收和發(fā)射光譜。當(dāng)以這種方式（參見圖3），消光系數(shù)和涉及相互轉(zhuǎn)換時作為一個功能的能量產(chǎn)量鏡像光譜的激發(fā)和發(fā)射光譜的強(qiáng)度之間的對稱。

圖4中的奎寧的吸收和發(fā)射光譜，自然發(fā)生的抗瘧疾劑（第一個已知的熒光團(tuán)）最初于1845年由約翰·弗雷德里克·威廉·郝薛爾的熒光性質(zhì)。的奎寧不堅(jiān)持鏡像規(guī)則，這是顯而易見通過檢查單峰的發(fā)射光譜（460納米），這并不反映在兩峰在雙峰吸收光譜在310和350納米的特色，。更短的波長的紫外線吸收峰（310納米），是由于激發(fā)過渡到第二激發(fā)態(tài)（從S（0） ，S（2） ），迅速松弛到最低激發(fā)態(tài)（S（1） ）。其結(jié)果是，會發(fā)生熒光發(fā)射專門從最低激發(fā)單重態(tài)（S（1） ），從而在一個頻譜鏡像地面，奎寧第一激發(fā)態(tài)的過渡（350納米的峰值），而不是整個的吸收光譜。

由于與熒光發(fā)射轉(zhuǎn)換（參見圖1-4）相關(guān)聯(lián)的能量通常是小于吸收，得到的發(fā)射的光子具有較少的能量，并移動到更長的波長。這種現(xiàn)象通常被稱為斯托克斯位移，并普遍采用的解決方案的調(diào)查，幾乎所有的熒光基團(tuán)發(fā)生。的斯托克斯位移（Stokes shift）的主要來源是激發(fā)電子的S（1）激發(fā)態(tài)的最低振動能級的快速衰變。此外，熒光發(fā)射通常是伴隨著由轉(zhuǎn)換到更高的振動能量水平的地面狀態(tài)，導(dǎo)致在熱平衡的多余的振動能量的激發(fā)能量的進(jìn)一步損失。其他事件，如溶劑的取向效應(yīng)，激發(fā)態(tài)的反應(yīng)，形成復(fù)合物，和共振能量轉(zhuǎn)移，也可有助于較長的發(fā)射波長。

斯托克斯位移（Stokes shift）在實(shí)踐中，被測量為在一個特定的熒光染料或熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜的最大波長之間的差異。的移位的大小不同的分子結(jié)構(gòu)，但可以從幾納米到幾百納米的范圍內(nèi)。例如，對于熒光素的斯托克斯位移（Stokes shift）是約20納米，而移位奎寧是110納米（參見圖4），卟啉是超過200納米。斯托克斯位移的存在是非常高的靈敏度的熒光成像測量的關(guān)鍵。紅色發(fā)射移位精度帶寬的光學(xué)過濾器的使用，使到達(dá)檢測器，以有效地阻止激發(fā)光從相對微弱的熒光信號（具有低發(fā)射的光子數(shù)），所以可以觀察到對一個低噪聲的背景。

消光系數(shù)，量子產(chǎn)率和熒光壽命，

在描述和比較熒光常用的三個基本參數(shù)的消光系數(shù)（ε），量子產(chǎn)率（Φ），和熒光壽命（τ）。摩爾消光系數(shù)被廣泛采用光譜，顯微鏡和熒光的字段中，以轉(zhuǎn)換成的各種化學(xué)物質(zhì)的摩爾濃度的單位的單位的吸光度。的消光系數(shù)確定為1摩爾濃度（ M ）（1摩爾每升）的目標(biāo)化學(xué)品具有一厘米的路徑長度中的比色皿，通過測量在參照波長（吸收分子的特征）的吸光度。參照波長通常是紫外線或可見光光譜中的最大吸收波長。消光系數(shù)是熒光團(tuán)，以吸收光的能力的直接量度，和那些具有高消光系數(shù)的生色團(tuán)也具有高的熒光發(fā)射的概率。此外，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)特性壽命（在下面討論）是成反比的消光系數(shù)，表現(xiàn)出高的消光系數(shù)的分子激發(fā)態(tài)和一個短的固有生命期。

量子產(chǎn)率（有時會錯誤地稱為量子效率）是一個計(jì)量表來測量的效率的熒光發(fā)射相對放松的所有可能的途徑，一般表示為發(fā)射到吸收的光子數(shù)的光子的比（無量綱）。換句話說，量子產(chǎn)率代表一個給定的激發(fā)的熒光染料將產(chǎn)生的發(fā)射光子（熒光）的概率。的量子產(chǎn)率通常范圍之間的一個零值，并且通常使用的熒光分子作為探針在顯微鏡有范圍從非常低（0.05或更?。?，以幾乎統(tǒng)一（最亮的熒光基團(tuán)）的量子產(chǎn)率。高量子產(chǎn)率在一般情況下，在大多數(shù)成像應(yīng)用中是可取的。一個給定的熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率變化，有時大極端，與環(huán)境因素，如pH值，濃度，和溶劑極性。

的熒光壽命為特征的分子仍然處于激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)的時間是一個指標(biāo)提供的信息，將收集到的排放概況。在激發(fā)態(tài)的壽命，熒光發(fā)生構(gòu)象變化以及與其它分子和漫過當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境進(jìn)行互動。用短暫的光脈沖激發(fā)的分子在一個統(tǒng)一的人口的作為時間的函數(shù)的熒光強(qiáng)度的衰減是由一個指數(shù)函數(shù)描述：

I(t) = Io ? e(-t/τ)

其中I（t）的是在時間噸的測得的熒光強(qiáng)度，I(o)激發(fā)后立即觀察到的初始強(qiáng)度，τ是熒光壽命。正式地說，是指在一定時間的熒光壽命，其中的初始熒光強(qiáng)度的熒光衰變的初始強(qiáng)度的1/e（約37％）（參見圖5的（a））。這個量是從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的熒光衰減的速率常數(shù)的倒數(shù)。

由于水平的熒光分子的激發(fā)單重態(tài)的數(shù)目成正比，壽命測量可以通過測量經(jīng)過短暫脈沖激發(fā)的熒光衰減進(jìn)行。在均勻的溶劑，熒光衰減通常是一個單指數(shù)函數(shù)，如示出的熒光強(qiáng)度的圖，圖5（a）和圖5（b）中作為時間的函數(shù)的。更復(fù)雜的系統(tǒng)，如活組織和活細(xì)胞，包含一套混合的環(huán)境中，往往產(chǎn)生多指數(shù)的值（圖5（c））時，熒光衰減測量。此外，還有一些其他進(jìn)程競爭與熒光發(fā)射返回到基態(tài)，激發(fā)態(tài)電子，包括內(nèi)部轉(zhuǎn)換，磷光（間竄躍）和淬火。除了熒光和磷光，非輻射過程的主要機(jī)制是放松的激發(fā)態(tài)電子。

所有非熒光進(jìn)程的爭奪的激發(fā)態(tài)電子的失活，可以方便地組合成一個單一的速率常數(shù)，稱為非輻射速率常數(shù)和變量k（nr）所表示。非輻射速率常數(shù)通常會忽略任何從振動弛豫的貢獻(xiàn)，因?yàn)檫@些轉(zhuǎn)換是快速的速度（皮秒）的幾個數(shù)量級的速度比慢失活（納秒級）轉(zhuǎn)換。因此，現(xiàn)在可以被表達(dá)的量子產(chǎn)率，速率常數(shù)是：

Φ=光子發(fā)射/吸收光子= kf/(kf + knf) = τf/τo

其中K（F）是用于熒光衰變（符號Γ也用于指定該速率常數(shù)）的速率常數(shù)。的衰變速率常數(shù)的倒數(shù)等于內(nèi)在的生命周期（T（O） ），它被定義為激發(fā)態(tài)的壽命在所有進(jìn)程的情況下，競爭激發(fā)態(tài)失活。在實(shí)踐中，由非輻射過程的熒光的激發(fā)態(tài)壽命縮短，導(dǎo)致測得的壽命（T（f）），這是一個組合的內(nèi)在壽命和競爭的非熒光弛豫機(jī)制。由于測得的壽命總是不到的內(nèi)在一生，量子產(chǎn)率從來沒有超過價值的統(tǒng)一。

光學(xué)顯微鏡中使用的共同的探針有許多以納秒為單位測得的熒光壽命，但這些可以在寬范圍內(nèi)變化，這取決于分子結(jié)構(gòu)，溶劑，和環(huán)境條件。定量熒光壽命測量，使研究者具有相似的光譜特征，但不同的生命周期的熒光團(tuán)之間的區(qū)別，并且還可以對當(dāng)?shù)丨h(huán)境的線索。具體而言，在探頭附近的pH值和濃度的離子可確定不知道的本地化的熒光基團(tuán)的濃度，這是使用時，與活細(xì)胞和組織的探針濃度可能不是均勻的顯著好處。此外，壽命測量是不敏感的漂白文物比強(qiáng)度測量。

淬火和漂白

淬火和光漂白的后果是有效地減少排放量，并在設(shè)計(jì)和執(zhí)行熒光調(diào)查，應(yīng)該是首要考慮的。這兩種現(xiàn)象往往是不同的淬火而漂白是不可逆的。猝滅來自各種競爭的進(jìn)程，誘導(dǎo)到基態(tài)時，這可能是在本質(zhì)上是分子內(nèi)或分子間的非輻射弛豫（沒有光子發(fā)射）的激發(fā)態(tài)電子。由于非輻射躍遷途徑競爭與熒光弛豫，他們通常顯著降低或者，在某些情況下，完全消除發(fā)射。大多數(shù)的淬火工藝的作用，以減少激發(fā)態(tài)的壽命和受影響的熒光量子產(chǎn)率。

一個常見的例子觀察淬火與激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)和另一個（非熒光）在溶液中，產(chǎn)生的熒光團(tuán)的失活，并返回到基態(tài)的分子的碰撞。在大多數(shù)情況下，既不的分子的化學(xué)變化中的碰撞猝滅過程。各種各樣的簡單的元素和化合物的行為作為碰撞猝滅劑，包括氧，鹵素，胺，和許多缺電子的有機(jī)分子。碰撞淬火可以揭示存在局部淬滅劑分子或基團(tuán)，通過擴(kuò)散或構(gòu)象的變化，可能發(fā)生碰撞的熒光在激發(fā)態(tài)的壽命。碰撞淬滅的機(jī)制，包括電子轉(zhuǎn)移，自旋-軌道耦合和系統(tǒng)間交叉的激發(fā)三重態(tài)。經(jīng)常使用的其他術(shù)語交替與碰撞淬火內(nèi)部轉(zhuǎn)換和動態(tài)猝滅。

第二種類型的猝滅機(jī)制，被稱為靜態(tài)或復(fù)雜的淬火，來自非熒光配合物之間形成的，用來限制通過減少人口的活性，可激發(fā)的分子吸收的淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)。產(chǎn)生這種情況的熒光物種時，形成了一個可逆的絡(luò)合物與猝滅劑分子在基態(tài)，并且不依賴于擴(kuò)散或分子碰撞。在靜態(tài)猝滅，熒光發(fā)射的減少而改變激發(fā)態(tài)的壽命。熒光基團(tuán)處于興奮狀態(tài)，也可以偶極共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制終止時，在鄰近的受體分子激發(fā)態(tài)能量可轉(zhuǎn)移到非輻射。在某些情況下，可以通過非分子機(jī)制，如衰減的入射光的吸收的物種（包括發(fā)色團(tuán)本身）發(fā)生淬火。

以淬火相反，光漂白（也稱為衰落）熒光團(tuán)時，會發(fā)生永久地失去熒光由于光子誘導(dǎo)化學(xué)損傷和共價修飾的能力。從激發(fā)單重態(tài)到三重態(tài)的過渡后，熒光基團(tuán)可以與另一個分子相互作用，以產(chǎn)生不可逆的共價修飾。相對長壽命三重態(tài)相對于單重態(tài)，從而使激發(fā)態(tài)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在環(huán)境中的組件的一個更長的時間范圍。的激發(fā)和發(fā)射周期所發(fā)生的一個特定的熒光漂白前的平均數(shù)量取決于分子結(jié)構(gòu)和當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境。一些熒光基團(tuán)快速漂白后只發(fā)射一個光子，而更健壯的人，可以進(jìn)行漂白前的數(shù)千或數(shù)百萬個周期。

圖6給出的是光漂白（褪色）中觀察到的一系列的數(shù)字拍攝的圖像，在不同的時間點(diǎn)為乘法染色培養(yǎng)牛肺動脈上皮細(xì)胞的一個典型例子。用4,6 -二脒基-2 -苯基吲哚（DAPI，藍(lán)色熒光）的細(xì)胞核進(jìn)行染色，而染色的線粒體和肌動蛋白細(xì)胞骨架與MitoTracker紅（紅色熒光）和鬼筆環(huán)肽衍生物（綠色熒光），分別。時間點(diǎn)取在兩分鐘的時間間隔，使用熒光過濾器的組合與調(diào)整，以激發(fā)熒光基團(tuán)，同時也記錄合并發(fā)射信號的帶寬。請注意，所有這三個熒光具有相對高的強(qiáng)度，在圖6（a），但DAPI（藍(lán)色）的強(qiáng)度開始迅速下降，在兩分鐘，以六分鐘，并幾乎完全消失了。線粒體和肌動蛋白的污漬更耐漂白，但強(qiáng)度都下降的過程（10分鐘）的時間序列。

光漂白事件的一類重要的是光動力，這意味著它們涉及的熒光團(tuán)的相互作用與光線和氧氣的組合。永久性的破壞熒光熒光基團(tuán)和分子氧之間的反應(yīng)產(chǎn)生自由基單線態(tài)氧的化學(xué)物種，可以修改其他分子在活細(xì)胞。光致漂白的量由于光動力事件是分子氧的濃度和熒光基團(tuán)，氧分子，和其他細(xì)胞成分的近端之間的距離的函數(shù)。光漂白，可以減少通過限制熒光照明的曝光時間，或通過降低能量的激發(fā)。然而，這些技術(shù)也減少了可測量的熒光信號。在許多情況下，溶液的熒光團(tuán)或細(xì)胞懸浮液可以脫氧，但活細(xì)胞和組織，這是不可行的。也許是最好的保護(hù)，防止光漂白是限制暴露的熒光激烈照明（使用中性密度過濾器），耦合與明智地使用市售的抗淬滅，可以被添加到安裝溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基中的試劑。

在某些情況下，也可以被利用的光漂白效果來獲得特定的信息，否則不會提供。例如，在后熒光恢復(fù)光漂白（FRAP）的實(shí)驗(yàn)中，一個目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的熒光團(tuán)是有意照射過量的漂白。隨著新的熒光基團(tuán)的分子擴(kuò)散到漂白區(qū)域的檢體（恢復(fù)），熒光發(fā)射強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測，以確定目標(biāo)熒光團(tuán)的橫向擴(kuò)散率。在這種方式中，平移的熒光標(biāo)記的分子的流動性，可以是一個單細(xì)胞或生物體組織部分（2至5微米）的一個非常小的區(qū)域內(nèi)確定。

溶劑效應(yīng)的熒光發(fā)射

各種環(huán)境因素的影響的熒光發(fā)射，包括熒光團(tuán)之間的相互作用和周圍的溶劑分子（取決于溶劑極性），其它溶解的無機(jī)和有機(jī)化合物，溫度，pH值，和本地化的熒光物種濃度。這些參數(shù)的效果有很大的不同從一個到另一個熒光團(tuán)，但大量的吸收和發(fā)射光譜，以及量子產(chǎn)率，可以由環(huán)境變量的影響。事實(shí)上，高靈敏度的熒光度，主要是由于在本地環(huán)境中的相互作用，發(fā)生在激發(fā)態(tài)的壽命。熒光基團(tuán)可以被認(rèn)為是一個完全不同的分子激發(fā)態(tài)（比基態(tài)），因此將顯示另外一組性能方面相對于基態(tài)的激發(fā)態(tài)與環(huán)境的相互作用。

在溶液中，也有周圍的溶劑分子的基態(tài)熒光團(tuán)，可以與熒光團(tuán)，得到的有序分布的周圍的熒光基團(tuán)的溶劑分子的偶極矩的偶極矩。中的熒光團(tuán)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能級之間的差異產(chǎn)生的分子的偶極矩的變化，最終誘導(dǎo)周圍的溶劑分子的重排。然而，在Franck-Condon原理決定，激發(fā)熒光團(tuán)時，分子被激發(fā)到一個更高的電子能級在遠(yuǎn)遠(yuǎn)短的時間內(nèi)，它需要比內(nèi)的溶劑 - 溶質(zhì)的熒光團(tuán)和溶劑分子的重新定位自己互動環(huán)境。作為結(jié)果，存在一個時間延遲之間的激發(fā)事件和溶劑分子周圍的溶劑化的熒光團(tuán)（如在圖7中示出），它一般具有大得多的比處于基態(tài)的激發(fā)態(tài)中偶極矩的重新排序。

后的熒光團(tuán)被激發(fā)到較高的振動水平的第一單重激發(fā)態(tài)（S（1） ），過量的振動能量被迅速失去周圍溶劑 分子作為熒光團(tuán)慢慢松弛到最低的振動能量（發(fā)生在皮秒時間規(guī)模）。溶劑分子協(xié)助穩(wěn)定并進(jìn)一步降低周圍的激發(fā)熒光團(tuán)在一個較慢的過程，需要在10和100之間皮秒重新定向（稱為溶劑松弛）的激發(fā)態(tài)的能量水平。這樣做的效果減少態(tài)和激發(fā)態(tài)，這將導(dǎo)致在一個紅色的移位（向長波長）的熒光發(fā)射之間的能量分離。增加溶劑的極性，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的能量水平的相應(yīng)較大的減少，降低溶劑極性的同時，降低了激發(fā)態(tài)的能量水平的溶劑效應(yīng)。的熒光基團(tuán)的極性也決定激發(fā)態(tài)的靈敏度的溶劑效應(yīng)。極性和電的熒光基團(tuán)表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果比非極性的熒光基團(tuán)。

熒光的溶劑放松的效果，可能會導(dǎo)致顯著的影響Stokes位移的大小。例如，該雜環(huán)的氨基酸色氨酸的吲哚部分通常駐留在其中周圍介質(zhì)的相對極性低的蛋白質(zhì)的疏水性內(nèi)部。用熱或化學(xué)劑的一個典型的宿主蛋白的變性后，色氨酸殘基被改變的環(huán)境從非極性高極性，在吲哚環(huán)地出現(xiàn)在周圍的水溶液。熒光發(fā)射波長約330納米至365納米，35納米的轉(zhuǎn)變，由于溶劑效應(yīng)增加。因此，可以采用發(fā)射光譜的內(nèi)在和外在的熒光探針探測溶劑極性的影響，分子協(xié)會，并具有極性和非極性的小分子和大分子的復(fù)合物的形成。

熒光定量調(diào)查應(yīng)不斷監(jiān)測，以掃描潛在的排放概況的變化，甚至當(dāng)他們不打算，也沒有預(yù)期。在簡單的系統(tǒng)，可以建立一個均勻的濃度，漸進(jìn)式發(fā)射強(qiáng)度增加，應(yīng)遵守的函數(shù)的熒光濃度增加，反之亦然。然而，在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，可能會發(fā)生變化的熒光探針的濃度本地在很寬的范圍內(nèi)，并且強(qiáng)度波動或光譜的移位往往因pH值的變化，鈣離子的濃度，能量轉(zhuǎn)移或猝滅劑的存在下，而不是熒光團(tuán)化學(xué)計(jì)量學(xué)。意想不到的溶劑或其它環(huán)境的影響的可能性，應(yīng)始終被視為在評價的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)程序。

熒光各向異性

熒光發(fā)射從各種各樣的試樣成為偏振光內(nèi)在或外在的熒光團(tuán)時，被激發(fā)的平面偏振光。偏振光發(fā)射的電平中所述的各向異性方面，顯示一定程度的各向異性的標(biāo)本，也表現(xiàn)出可檢測水平的偏振光發(fā)射。熒光各向異性的觀察與測量的基礎(chǔ)上的光選擇性激發(fā)的熒光基團(tuán)由于瞬態(tài)取向與取向的電場矢量（偏振光）的照明的光子的吸收偶極矩。當(dāng)熒光團(tuán)吸收的入射的光子，激發(fā)事件從入射的輻射的振蕩電場成分和創(chuàng)建的熒光團(tuán)的分子軌道的電子狀態(tài)的躍遷偶極矩之間的相互作用產(chǎn)生。熒光團(tuán)優(yōu)先吸收那些光子具有的電場矢量平行排列的熒光團(tuán)的吸收躍遷偶極矩。

熒光發(fā)射，也會發(fā)生在一個平面上的發(fā)射躍遷偶極矩的方向所定義的。每個熒光團(tuán)已固定在其分子框架內(nèi)的吸收和發(fā)射躍遷偶極矩（圖8），其中已經(jīng)定義了相對于中的染料分子的分子軸的方向，并彼此分開的角度（θ）。呈現(xiàn)在圖8是一個假設(shè)的三核的芳族雜環(huán)基的熒光團(tuán)（布置類似吖啶環(huán)系統(tǒng)）用箭頭表示的空間關(guān)系的吸收（黃色箭頭）和發(fā)射（紅色箭頭）躍遷偶極矩矢量重疊。在激發(fā)態(tài)的壽命（τ）中，熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)將其排放到激勵矢量相對于去極化，導(dǎo)致在測量環(huán)境中含有的熒光團(tuán)的剛性的一種機(jī)制。

含有隨機(jī)取向的熒光團(tuán)與平面偏振光的各向同性溶液的照明將優(yōu)先激發(fā)只有那些分子的吸收躍遷偶極矩平行對齊的（或接近）的偏振向量電平面。吸收的概率實(shí)際上是偶極子和入射光的電場矢量（吸收為最大時的角度為零度和達(dá)到最小的角度接近90度）之間的角度的余弦平方成正比。其結(jié)果將是一個人口激發(fā)熒光基團(tuán)從原來的合奏一個的特定photoselection過程中，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)熒光基團(tuán)面向一個特定的軸平行。從該亞群的熒光發(fā)射也將是部分偏振。測量的激發(fā)和發(fā)射躍遷偶極矩之間的相對角的偏振（p）或各向異性（?）確定的程度，如由等式給出：

p = (I|| - I⊥)/(I|| + I⊥) and r = (I|| - I⊥)/(I|| + 2I⊥) 

其中，I（| |）是激發(fā)的平面平行的平面中測量的熒光發(fā)射，I（⊥）是激發(fā)的平面垂直的平面中測量的熒光發(fā)射。在實(shí)踐中，偏振光的量計(jì)算通過測量發(fā)射激勵光路徑中放置的偏振器和分析器對取向平行或垂直于激發(fā)偏振器（參見圖9）中的發(fā)射光的路徑下收集。各向異性和偏振都表達(dá)同樣的現(xiàn)象和值可以很容易地相互轉(zhuǎn)化。的各向異性的表達(dá)是優(yōu)選的，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)方程是簡單表示時，在此參數(shù)方面。

因?yàn)榘l(fā)射躍遷偶極矩是從激發(fā)躍遷矩位移由于空間定向（參見圖8），將發(fā)生某種程度的去極化，即使熒光團(tuán)被固定在適當(dāng)位置。因此，吸收過程本身是熒光去極化的第一源極。旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的熒光，它總是發(fā)生在激發(fā)態(tài)的壽命，更多的人流離失所的發(fā)射躍遷偶極方向從原來的結(jié)果，將進(jìn)一步降低觀測到的排放各向異性。的旋轉(zhuǎn)速率是依賴熒光基團(tuán)（或它的約束的大分子）的大小和其本地化環(huán)境的粘度。可以與由佩蘭方程的熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)流動性的溶液的熒光各向異性：

r0/r = 1 + (RTτ)/(ηV)

其中，R（0）是限制各向異性（中觀察到的情況下的任何熒光旋轉(zhuǎn)的各向異性），r是測得的異向性，η是粘度的環(huán)境， V 是在旋轉(zhuǎn)的分子的體積， R 是通用氣體常數(shù)， T 是該溶液的溫度的絕對溫標(biāo)上，和τ的熒光的激發(fā)態(tài)的壽命。在實(shí)踐中，佩蘭方程簡化表達(dá)的時間依賴性的衰減的各向異性方面的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間（Φ）的熒光團(tuán)：

r0/r = 1 + τ/Φ where Φ = (ηV)/(RT)

其中的現(xiàn)象，導(dǎo)致（低級），測得的熒光各向異性值脫離的最大的理論極限是天然的分子旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散的過程中發(fā)生的激發(fā)態(tài)的壽命。在溶液中，分子量小的熒光團(tuán)（最多到幾千道爾頓）的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間范圍在50和100之間皮秒，這是顯著的速度比的發(fā)射和位移率，或隨機(jī)分布，發(fā)射躍遷偶極矩。因?yàn)橐粋€典型的熒光基團(tuán)的平均激發(fā)態(tài)壽命是在納秒范圍，分子是能夠旋轉(zhuǎn)無數(shù)次之前排放。其結(jié)果是，偏振光發(fā)射是隨機(jī)的，因此凈各向異性為零。第二個（但更罕見）機(jī)制通常所觀察到的各向異性下降是熒光基團(tuán)之間的激發(fā)能轉(zhuǎn)移。

協(xié)會的熒光團(tuán)與一個更大的大分子的查詢結(jié)果中的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間的顯著增加。在大多數(shù)情況下，一個大的蛋白質(zhì)在溶液中的相關(guān)時間范圍從10到50毫微秒，其中等于或超過一個典型的熒光基團(tuán)的平均激發(fā)態(tài)壽命。熒光團(tuán)的結(jié)合減慢的熒光探針的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，使主機(jī)蛋白的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間的調(diào)查。較小的蛋白質(zhì)通常顯示比較大的蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)涉及復(fù)雜的生物組件的相關(guān)性時間要短得多，并且可以預(yù)計(jì)將產(chǎn)生較低的各向異性。

用光學(xué)顯微鏡測量熒光偏振的工具的方法，提出在圖9中。平面偏振光的激發(fā)光產(chǎn)生的通過電弧放電照明燈的光通過一個線性偏振器。熒光在試樣（在顯微鏡載玻片上）偶極矩的吸收的激發(fā)光的平面平行取向的平面偏振光的激發(fā)光被吸收最大。這將導(dǎo)致在一個特定的子群的熒光基團(tuán)被激發(fā)（熒光基團(tuán)的各向異性集合）。在理論上，所有的激發(fā)的熒光基團(tuán)具有相同的方向，吸收和發(fā)射偶極矩。在相對于激勵照明的偏振平面平行和垂直的方向測量，其隨后發(fā)射的熒光團(tuán)的熒光。由于熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)在其激發(fā)態(tài)壽命期間，觀察到的發(fā)射水平平行的平面的激發(fā)會不斷減少，而排放量的記錄垂直于平面的激發(fā)將同時增加。

正如上面所討論的，熒光各向異性測量可以提供上的旋轉(zhuǎn)流動性的蛋白質(zhì)，其分子量和形狀可以推斷出的信息。此外，分子間的關(guān)聯(lián)可以被監(jiān)測，以及構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)變性。該技術(shù)也被審查內(nèi)部蛋白質(zhì)的靈活性和數(shù)量的生物膜的物理性能，包括粘度，相變，化學(xué)組合物，和對這些性能的膜擾動的影響?？梢苑€(wěn)態(tài)系統(tǒng)采用連續(xù)照明時間分辨實(shí)驗(yàn)中利用脈沖激發(fā)事件的熒光各向異性的測量。

共振能量轉(zhuǎn)移

甲在激發(fā)態(tài)的熒光基團(tuán)如上面所討論的，可以失去激發(fā)能量通過將其轉(zhuǎn)換成光（熒光），通過熱平衡（振動弛豫），或轉(zhuǎn)移到另一分子通過碰撞或復(fù)合物的形成（非輻射耗散和淬火）。以形成復(fù)合物或與溶劑分子碰撞，由耦合之間的熒光團(tuán)和第二個分子的電子軌道的能量被轉(zhuǎn)移。也有另一種過程，稱為共振能量轉(zhuǎn)移（RET），其中在激發(fā)態(tài)的熒光基團(tuán)（稱為供體）可以其激發(fā)能轉(zhuǎn)移到相鄰的發(fā)色團(tuán)（受體）的非輻射通過遠(yuǎn)距離偶極-偶極在納米測量距離的交互。假設(shè)共振能量轉(zhuǎn)移的供體熒光團(tuán)的基本理論，可以被視為一個振蕩的偶極子，可以將能量轉(zhuǎn)移到類似的偶極子在一個特定的共振頻率中的類似的方式耦合振子的行為，如對音叉振動在相同的頻率。

共振能量轉(zhuǎn)移是潛在可能時，供體熒光團(tuán)的吸收光譜的受體，這本身不一定是熒光重疊的發(fā)射光譜。了解這種機(jī)制的能量轉(zhuǎn)移的一個重要概念是，加工過程中不涉及捐助隨后的受體發(fā)出的光子的吸收光的發(fā)射。換句話說，不存在中間的共振能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制參與光子。表現(xiàn)的能量轉(zhuǎn)移的供體熒光發(fā)射在受體的存在下和提高（敏化）的排放，受體熒光猝滅雙方。

呈現(xiàn)在圖10的分光公司從耦合發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移的供體和受體分子的發(fā)光強(qiáng)度的變化。的過程中發(fā)生重疊（灰色區(qū)域）之間的供體發(fā)射（中央灰色曲線）和受體吸收光譜的（中心黃色曲線）是必需的。當(dāng)這種重疊是存在的，供體和受體的分離小于10納米，供體的激發(fā)能可轉(zhuǎn)讓的非輻射的受體。凈結(jié)果是淬火的供體熒光發(fā)射（紅色曲線）和受體（致敏發(fā)射的發(fā)光強(qiáng)度增加，紅色虛線曲線）。個人光譜的供體和受體在圖10中可以使用傳說中的上左上角的數(shù)字標(biāo)識。

共振能量轉(zhuǎn)移的效率隨光譜重疊的程度，但最重要的是，作為第六功率的距離（半徑河）的逆的供體和受體生色團(tuán)分離。受體的能量轉(zhuǎn)移到需要的生色團(tuán)之間的距離比較接近，為1至10納米的邊界內(nèi)的限制。激勵標(biāo)記的試樣的照明的波長相對應(yīng)的供體和受體的峰值發(fā)射波長區(qū)域中檢測熒光發(fā)射的吸收（激發(fā)）最多可以檢測到的現(xiàn)象?；蛘呖梢詼y量的受體的存在和缺乏，供體的熒光壽命。能量傳遞效率上的供體和受體之間的分離距離的依賴，提供細(xì)胞生物學(xué)的研究中的實(shí)用程序的共振能量轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。此方面的共振能量轉(zhuǎn)移，使可以使用的技術(shù)來作為分光標(biāo)尺研究和量化細(xì)胞成分之間的相互作用，以及在單個大分子的構(gòu)象變化，在分子水平上。

必須建立一組特定條件發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移。供體生色團(tuán)必須是能夠耦合到一個足夠長的壽命與合理的量子產(chǎn)率的熒光，施主和受主分子之間的距離必須是相對較短（在大多數(shù)情況下，只有幾納米）。此外，如上面所討論的，設(shè)計(jì)的共振能量轉(zhuǎn)移調(diào)查不涉及受體所考慮的實(shí)際的光的重吸收。率（K（T） ）的能量轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移效率（E（T） ）都有關(guān)的供體中的受體的存在或不存在的壽命。能量轉(zhuǎn)移的速率常數(shù)，表示為：

KT = (1/τD) ? (R0/r)6

其中，R（0）福斯特距離是至關(guān)重要的，這是其中的能量轉(zhuǎn)移的概率等于捐助激發(fā)率（衰減）的受體在沒有的施主-受主分離半徑。因此，福斯特距離，通常大多數(shù)共振能量轉(zhuǎn)移測量范圍2和7納米之間，是能量轉(zhuǎn)移的效率是50％的發(fā)色團(tuán)之間的距離。另外，在方程中，τ（D）是使用的變量來表示在沒有受體的供體的壽命， 和 r 是分離的施主和受主分子的距離。通過檢查等式中，很明顯的共振能量轉(zhuǎn)移率是等于受體沒有捐助衰減率（倒數(shù)的壽命）時，發(fā)色團(tuán)之間的半徑是等于福斯特距離。此時，轉(zhuǎn)移效率為50％的供體發(fā)射將減少到二分之一的受體的情況下的正常強(qiáng)度。由于能量轉(zhuǎn)移率的分離距離的6次方成反比，供體和受體之間的接近程度是清楚的主要術(shù)語。臨界福斯特距離，以納米表示，按照以下方程來計(jì)算：

R0 = 2.11 × 10-2 ? [η-4Q0κ2J(λ)]1/6

福斯特距離方程引入κ2（κ平方），這是一個描述在三維空間中的供體和受體的吸收和發(fā)射偶極子之間的空間關(guān)系的取向系數(shù)的概念。如果偶極取向之間的兩個發(fā)色團(tuán)（由于快速旋轉(zhuǎn)的施主和受主分子）是隨機(jī)的，取向因子取統(tǒng)計(jì)平均等于（三分之二或0.67的值）對于大多數(shù)計(jì)算R（0）。發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的介質(zhì)的折射率被表示為變量η，和Q（0）是在沒有受體的供體的量子產(chǎn)率。重疊積分，J（λ）中，定義的供體發(fā)射和受體的吸收光譜（圖10中所示的灰色陰影區(qū)域）之間的重疊區(qū)域。能量傳遞效率（E（T） ）相關(guān)的距離分離的供體和受體（ R ），由以下方程：

r = R0[(1/ET) - 1]1/6 where ET = 1 - (τDA/τD)

因此，通過測量在受體（τ（DA） ）的存在下和無受體（τ（D） ）的供體的熒光壽命，可以分離兩個生色團(tuán)的能量傳遞效率和距離確定。由于共振能量轉(zhuǎn)移的效率在很大程度上受供體和受體的擴(kuò)散供體的生命周期，時間分辨測量是最適合的空間波動系統(tǒng)的分析。轉(zhuǎn)印效率，也可以測定由穩(wěn)態(tài)的技術(shù)，使用的供體中的受體的存在和不存在的相對熒光發(fā)射強(qiáng)度。然而，這些計(jì)算是有限的供體和受體的情況下，由一個固定的距離分離，如當(dāng)兩個發(fā)色團(tuán)被綁定到相同的大分子。這是不綁定到不同的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和核酸的酸，其中的時間分辨的信息通常是必要的情況下，供體和受體。同樣地，對于在溶液中的發(fā)色團(tuán)的混合物，或隨機(jī)分散在膜中，更復(fù)雜的計(jì)算，考慮空間分布的分子的平均傳輸率是必要的。

共振能量轉(zhuǎn)移調(diào)查提供獨(dú)特的信息相比來自替代實(shí)驗(yàn)涉及熒光各向異性，溶劑松弛，淬火，或最激發(fā)態(tài)反應(yīng)。熒光定量測量的大多數(shù)依賴于短距離在附近，包括周圍的溶劑分子的熒光團(tuán)和其他分子之間的相互作用。與此相反，溶劑的影響，甚至大的大分子（如蛋白質(zhì)或核酸）的存在下有供體和受體之間的能量轉(zhuǎn)移的效率上的影響不大。測量共振能量轉(zhuǎn)移的主要考慮因素，與其他技術(shù)不同的是，實(shí)際的供體和受體分子之間的物理距離。

結(jié)論

即使出現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，幾乎是瞬時的，與當(dāng)前儀器吸收光子并和由熒光團(tuán)的第二個光子的發(fā)射之間的相對長的時間內(nèi)打開的門，有相當(dāng)數(shù)量的調(diào)查使用此顯著的方法。調(diào)色板中的熒光技術(shù)的吸收和發(fā)射光譜，量子產(chǎn)率的明顯變化，生存，淬火，漂白，各向異性，能量轉(zhuǎn)移，溶劑效應(yīng)，擴(kuò)散，形成復(fù)合物，以及一系列的環(huán)境變量。所有這些因素都可以很容易地評估通過穩(wěn)定狀態(tài)或內(nèi)在的和外在的熒光基團(tuán)的光譜特性，時間分辨的解釋。

當(dāng)耦合到光學(xué)顯微鏡，熒光，研究人員在細(xì)胞生物學(xué)研究一個廣泛的現(xiàn)象。最重要的是亞細(xì)胞的組件，如細(xì)胞核，細(xì)胞膜，細(xì)胞骨架的長絲，線粒體，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的特定的大分子的細(xì)胞內(nèi)分布的分析。除了穩(wěn)態(tài)細(xì)胞解剖觀察，熒光探測細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)和各種大分子之間的相互作用，包括擴(kuò)散，結(jié)合常數(shù)，酶促反應(yīng)速率，以及各種不同的反應(yīng)機(jī)理，也是有用的，在時間分辨測量。其他重要的進(jìn)程也調(diào)查的高度特異性和空間分辨率可與熒光顯微鏡使用的目標(biāo)。例如，熒光探針已被用來監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的pH值和本地化重要的離子濃度，細(xì)胞存活率和凋亡率的影響因素的研究和。同樣的，重要的細(xì)胞功能，如內(nèi)吞作用，胞吐，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜電位的產(chǎn)生，熒光顯微鏡下研究。在審查大量的應(yīng)用程序受益于熒光分析，熒光顯微鏡的顯著效用是明顯的，為什么推動了這項(xiàng)技術(shù)的最前沿生物醫(yī)學(xué)研究。