尼康顯微鏡試樣制備及成像

尼康顯微鏡試樣制備及成像

程序，在共聚焦顯微鏡制備和成像標(biāo)本主要來(lái)自那些已經(jīng)發(fā)展了許多年，與傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)顯微鏡使用這一點(diǎn)。 在制定的檢體的新協(xié)議的最佳方法用共聚焦顯微鏡成像是開(kāi)始與一個(gè)已知的適合于傳統(tǒng)的顯微鏡，并根據(jù)需要對(duì)其進(jìn)行修改。

不管所采用的樣品制備協(xié)議，在其中共聚焦顯微鏡下進(jìn)行的方式的主要優(yōu)點(diǎn)是在圖像顯示和分析導(dǎo)致從同時(shí)采集多個(gè)圖像，以數(shù)字形式，到計(jì)算機(jī)的靈活性。 這在下面更詳細(xì)討論的，但在圖像顯示可能性之一優(yōu)雅的例子是在圖1中，一個(gè)三重標(biāo)記果蠅胚胎在細(xì)胞胚階段。 將試樣免疫熒光標(biāo)記的抗體，以三種不同的蛋白質(zhì)。 之后被收集在共聚焦系統(tǒng)中的紅，綠和藍(lán)色通道3相應(yīng)的圖像時(shí)，圖像可以通過(guò)將它們復(fù)制到不同的信道被重新安排。 通過(guò)評(píng)估從合并3所得的圖像時(shí)，最有效的顏色到的信道分配用于說(shuō)明各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域被選擇。 圖1表示在合并三通道圖像（組合紅，綠，藍(lán)信道）。

大部分，在制備試樣的常規(guī)寬視場(chǎng)光學(xué)顯微鏡已證明是成功的方法是專門(mén)旨在降低的離焦的熒光的量，因?yàn)檫@將產(chǎn)生眩光的圖像，極大地減少了所感興趣的特征的分辨率在。 由于由共聚焦方法所取得的光學(xué)切片，相比于常規(guī)落射熒光顯微鏡的共聚焦顯微鏡采樣不足在一個(gè)厚的樣品的熒光。 其結(jié)果是，樣品可能需要進(jìn)行共聚焦分析增加染色倍或污點(diǎn)的濃度，并且如果評(píng)價(jià)在常規(guī)的顯微鏡，可能表現(xiàn)為過(guò)度染色。

雖然在典型的激光掃描共聚焦系統(tǒng)中的照明似乎是極亮，在試樣上的任何給定的點(diǎn)的平均照度相對(duì)溫和，由于這樣的事實(shí)，許多點(diǎn)每秒掃描。 以每1.6微秒一個(gè)點(diǎn)一個(gè)典型的掃描速度，在任何給定點(diǎn)實(shí)際照度通常比傳統(tǒng)寬視場(chǎng)落射熒光顯微鏡更少。 它通常建議使用最低的激光功率即實(shí)用成像，以保護(hù)該熒光團(tuán)。 雖然許多協(xié)議包括反漂白劑，以防止熒光物種的衰落，這種添加劑可以不需要與許多更現(xiàn)代的共聚焦儀器。

共聚焦顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用是更厚的標(biāo)本改進(jìn)的成像能力，盡管成功可以通過(guò)檢體的特定性能的限制。 為標(biāo)本某些最低的物理要求適用; 它必須適應(yīng)在顯微鏡的階段，和感興趣的區(qū)域必須能夠被放置在物鏡的工作距離范圍內(nèi)。 在某些情況下，分辨率可以具有以容納試樣，并且避免損壞它或物鏡受到損害。 例如，高分辨率透鏡，例如具有60倍的1.4的數(shù)值孔徑可以具有170微米的工作距離，而一個(gè)20×（具有0.75的典型數(shù)值孔徑）可以提供一個(gè)相對(duì)較大的660微米的工作距離，以能夠訪問(wèn)一個(gè)樣本更受限制的地區(qū)沒(méi)有物理干擾。

試樣具有三維結(jié)構(gòu)，它是待研究的共聚焦顯微鏡，必須被安裝在這樣一種方式，以保持結(jié)構(gòu)。某種間隔物，如漁線或一塊蓋玻片的，通常被放置在載玻片和蓋玻片，以避免變形試樣之間。當(dāng)活樣品進(jìn)行研究時(shí)，通常需要將它們安裝在一室中，提供所有的生命必需的要求，并且也將允許通過(guò)物鏡到圖像所需的區(qū)域足夠的訪問(wèn)。

檢體性質(zhì)影響光傳輸，如不透明度和濁度，可以在激光束的穿透深度大大影響到檢體，因此，可以被成像的結(jié)構(gòu)。 眼睛的未定影和未染色的角膜上皮，例如，相對(duì)透明和激光束將它穿透到大約200微米的深度。 與此相反，未定影的皮膚是相對(duì)不透明并散射更多的光，這限制了激光穿透至約10微米。 許多固定的協(xié)議包括某種形式的清除劑的目的是增加所述組織的透明度。

如果有足夠的激光穿透不能與一個(gè)整裝樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)，厚的部分可以用切片機(jī)進(jìn)行切割。 固定的組織通常用于切片，但組織（如活腦）已減少的振動(dòng)切片機(jī)并成功成像。 要訪問(wèn)一個(gè)部分的較深部分安裝，所以能夠從載玻片取出試樣，倒轉(zhuǎn)，并重新裝入它，但是這通常不是很成功。從樣本的稍微更深部位圖象可以通過(guò)使用被激發(fā)在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（例如花青5），相對(duì)于那些需要更短的波長(zhǎng)激發(fā)的染料來(lái)獲得。 使用較長(zhǎng)波長(zhǎng)的照明會(huì)，然而，稍減少，可以相比于在較短的波長(zhǎng)獲得的圖像來(lái)實(shí)現(xiàn)的最大分辨率。 出于類似的原因，多光子成像技術(shù)允許圖像被從樣本內(nèi)更深層次（由于使用的紅色光為激發(fā)）搜集。

物鏡

對(duì)于共聚焦顯微鏡的研究，所用的物鏡的選擇是極其重要的，因?yàn)樵撏哥R的聚光能力，測(cè)定其數(shù)值孔徑，是既分辨率和光學(xué)部厚度的一個(gè)決定因素。 保持其他顯微鏡變量不變，較高的物鏡的數(shù)值孔徑是，較薄的光學(xué)部分會(huì)。 作為例子，將一個(gè)特定的儀器，使用的是60倍（1.4數(shù)值孔徑）的光學(xué)切片厚度與針孔直徑設(shè)定以1mm目的是約0.4微米，并與透鏡16倍（0.5的數(shù)值孔徑），具有相同的1-毫米針孔，切片厚度為1.8毫米的量級(jí)上。 通過(guò)打開(kāi)針孔到較大的直徑，該光學(xué)部的厚度可以增加。 表1給出了光學(xué)部的厚度值（以微米）關(guān)于各種物鏡在兩個(gè)不同的針孔直徑對(duì)于LSCM之一模型。 圖像分辨率總是較差垂直比它水平。 例如，使用60倍，1.4的數(shù)值孔徑，物鏡的水平分辨率是約0.2微米，垂直分辨率為約0.5微米。 場(chǎng)和色差的平整度時(shí)，選擇的物鏡要考慮附加透鏡的特性。 成像多標(biāo)記標(biāo)本在不同波長(zhǎng)時(shí)的色差校正的程度是特別重要的。

物鏡，其能夠最高分辨率的通常是那些具有最高放大率和最高的數(shù)值孔徑。 它們也是最昂貴的，因此折衷經(jīng)常被掃描試樣的面積，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于該區(qū)域的最大分辨率之間進(jìn)行比較。如果成像昆蟲(chóng)胚胎和成蟲(chóng)磁盤(pán)，例如，一個(gè)4倍透鏡可能被用于定位試樣上滑動(dòng)，鏡頭16倍（0.5數(shù)值孔徑）進(jìn)行成像全胚胎和40倍（1.2數(shù)值孔徑）或60倍解決胚胎或成蟲(chóng)盤(pán)內(nèi)的個(gè)別細(xì)胞核鏡頭（數(shù)值1.4光圈）。 成像較大的組織，如蝴蝶成蟲(chóng)盤(pán)，4倍帶透鏡將是整個(gè)翼磁盤(pán)是有用的，并且在40倍或60倍于單個(gè)細(xì)胞的分辨率。 圖2（a）示出使用了4倍物鏡以獲得整個(gè)蝴蝶五齡翼成蟲(chóng)盤(pán)的整體圖，并且通過(guò)一個(gè)16倍透鏡提供的額外核細(xì)節(jié)（圖2（b））。 其中高分辨率和大視場(chǎng)的圖像可被組合的一種方法是獲得許多圖像從相鄰的區(qū)域，并將它們進(jìn)行數(shù)字組合成的蒙太奇。 一些顯微鏡已經(jīng)自動(dòng)化，可以設(shè)置走動(dòng)試樣和收集多個(gè)圖像轉(zhuǎn)換成的大面積的蒙太奇XY階段。

一個(gè)更實(shí)用的功能，是最LSCMs的特性是放大的圖像的能力，使用相同的物鏡，在不損失分辨率。 這種能力是通過(guò)減少由激光掃描檢體的區(qū)域中，通過(guò)的掃描鏡控制簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)，同時(shí)保持相同的圖像的顯示尺寸或存儲(chǔ)器存儲(chǔ)陣列的大小，有效地增加了放大率。 這樣，多個(gè)放大倍數(shù)而不干擾樣品或在視場(chǎng)失去軌道的參考點(diǎn)與單個(gè)透鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 只要有可能，但是，更高的數(shù)值孔徑的透鏡，應(yīng)使用以最大化分辨率，而不是使用較低數(shù)值孔徑的透鏡變焦。用一個(gè)單一的透鏡（40倍）放大的能力表示在圖2（CF）。 數(shù)字面板（c）所示的40倍的物鏡（相對(duì)于16倍視圖面板（b））提供的額外核的細(xì)節(jié)。 到（f）板（d）是通過(guò)累進(jìn)的，通過(guò)減少掃描在試樣上的區(qū)域來(lái)完成變焦相同40X透鏡獲得的圖像。

若干共聚焦儀器設(shè)計(jì)的具有可調(diào)節(jié)的針孔限制離焦的光到達(dá)檢測(cè)器。 打開(kāi)針孔到較大直徑產(chǎn)生較厚的光學(xué)部分和減小的分辨率，但往往是必要的，以包括更多的樣品細(xì)節(jié)或增加撞擊檢測(cè)器的光。 如針孔被關(guān)閉（直徑減?。┧龉鈱W(xué)部的厚度及亮度下降。 分辨率增加，直到一定的最小的針孔直徑達(dá)到，超過(guò)此分辨率不增加，但亮度繼續(xù)降低。 針孔直徑在其達(dá)到該條件是每個(gè)物鏡不同。

探針共聚焦成像

共聚焦儀器的發(fā)展繼續(xù)既影響，并通過(guò)改善免疫熒光定位新的熒光探針的合成的影響。 熒光染料被引入具有激發(fā)和發(fā)射光譜更緊密地匹配由與大多數(shù)商業(yè)LSCMs供給的激光器產(chǎn)生的波長(zhǎng)。 改進(jìn)的探針可以綴合到目前的研究興趣的抗體正在不斷的發(fā)展。 作為一個(gè)例子染料組，花青已經(jīng)發(fā)展成為替代其他歷史悠久的染料，用花青3，以羅丹明一個(gè)光明的選擇，花青5的發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多地使用三聯(lián)標(biāo)簽策略。

熒光原位雜交（FISH），具有在分辨率和探針檢測(cè)的靈敏度加上的LSCM時(shí)被進(jìn)一步提高的優(yōu)點(diǎn)，并且是用于成像熒光標(biāo)記的DNA和RNA序列在細(xì)胞中的分布的有價(jià)值的方法。 此外，更亮的熒光探針是目前可用于在兩個(gè)細(xì)胞核和分離的染色體總DNA的LSCM成像。

是可用的，當(dāng)在相對(duì)簡(jiǎn)單的協(xié)議并入，特別是染色的某些細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)的大量的熒光探針。間可用探針的過(guò)多是染料標(biāo)記的核，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和，并且還染料物鏡聚合肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞中，如鬼筆環(huán)肽熒光標(biāo)記。 這樣的染料是在多個(gè)標(biāo)簽的方法非常有用以定位具有在細(xì)胞中的特定隔室的興趣抗原。 例如，圖3呈現(xiàn)的鬼筆環(huán)肽和核染料（TOPRO）與施加到蝶蛹翼成蟲(chóng)盤(pán)整體裝有一三重標(biāo)記方案的適當(dāng)?shù)目乖嘟Y(jié)合的工作。 如圖3的（a），鬼筆環(huán)肽可用于強(qiáng)調(diào)細(xì)胞概述在開(kāi)發(fā)組織中，與周邊的肌動(dòng)蛋白小梁被標(biāo)記為明亮的熒光環(huán)。 該圖的圖（b）示出了在標(biāo)記只是一個(gè)蜂窩部件的核染料的戲劇性特異性。 除了這種蜂窩室的標(biāo)記策略，抗體在細(xì)胞（如抗微管蛋白）已知分布或功能的蛋白可有效地包含在多標(biāo)記研究。

如果活細(xì)胞都被成像時(shí)，要注意的添加熒光染料對(duì)系統(tǒng)的影響是至關(guān)重要的。 這些探頭可以是有毒的活細(xì)胞，尤其是當(dāng)他們興奮的激光。 有毒的影響是通過(guò)加入抗壞血酸到細(xì)胞培養(yǎng)基中減少一些準(zhǔn)備協(xié)議。 該標(biāo)記的特定細(xì)胞成分可以在成像期間會(huì)影響細(xì)胞的活力。 例如，污漬的細(xì)胞核往往具有比細(xì)胞質(zhì)污漬更有害作用。 探針是可用的活細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分（其中這些是吖啶橙），并且可以在成像期間被用于在細(xì)胞活力測(cè)定。 大多數(shù)此類測(cè)定法是基于的前提是，死細(xì)胞的膜是可滲透的許多材料，如染料，不能穿透它們?cè)诨畹臓顟B(tài)。

的Fluo-3和RHOD-2是已合成以改變?cè)谀承╇x子如鈣的存在下其熒光特性的染料的例子。 新的探針已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于成像的基因表達(dá)，包括例如，水母綠色熒光蛋白（GFP），使基因表達(dá)和蛋白定位在體內(nèi)進(jìn)行觀察。 利用綠色熒光蛋白，使基因表達(dá)的監(jiān)測(cè)在許多不同的細(xì)胞類型，包括活果蠅卵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以及植物（使用LSCM的激發(fā)激光的488nm處線）。可用于在多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)使用的GFP與光譜變化的突變體，并且這些人還發(fā)現(xiàn)使用用于避免干擾自體熒光的活組織。

自體熒光

組織自發(fā)熒光天然存在于許多類型的細(xì)胞，并且可以是對(duì)背景干擾成像過(guò)程中的一個(gè)主要來(lái)源。 例如，葉綠素在酵母和植物細(xì)胞熒光在光譜的紅色部分。 某些試劑，例如戊二醛固定劑，是自體熒光的來(lái)源，這可以通過(guò)處理來(lái)減少與氫硼化。 自發(fā)熒光有時(shí)可以避免使用可在波長(zhǎng)超出天然的自體熒光的范圍內(nèi)被激發(fā)的熒光團(tuán)。 花青5通常選擇，因?yàn)樗窃诩ぐl(fā)波長(zhǎng)較長(zhǎng)，避免了短波長(zhǎng)的自體熒光。

雖然它是最經(jīng)?？紤]的一個(gè)問(wèn)題，組織自發(fā)熒光可以用于成像整體細(xì)胞形態(tài)為多重標(biāo)記研究的一部分。 從自體熒光的總熒光的貢獻(xiàn)可以通過(guò)查看未染色標(biāo)本在不同波長(zhǎng)，并指出，激光功率和黑電平及增益的PMT設(shè)置進(jìn)行評(píng)估。 自發(fā)熒光通常可以漂白通過(guò)短暫暴露于激光在高功率，或通過(guò)從水銀燈充斥標(biāo)本的光。 更復(fù)雜的方法來(lái)處理自體熒光包括使用時(shí)間分辨成像，或者使用諸如圖像減法數(shù)字圖像處理技術(shù)去除。

收集圖片

共聚焦顯微鏡的初級(jí)用戶能夠獲得在幾個(gè)方面的經(jīng)驗(yàn)。 由制造商提供的顯微鏡手冊(cè)通常包括一系列必要的入門(mén)簡(jiǎn)單的程序。 在大多數(shù)多用戶設(shè)備，主要負(fù)責(zé)人的操作儀器可以提供情況介紹會(huì)，或設(shè)施經(jīng)理可能需要一定的專業(yè)水平很短的訓(xùn)練和示范獨(dú)奏使用該儀器被允許之前。應(yīng)特別注意支付給工廠的家規(guī)。 信息和培訓(xùn)，也可以從顯微鏡進(jìn)行企業(yè)培訓(xùn)課程得到，從研討會(huì)顯微鏡，并從各種出版物。

之前的工作與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行，它是必不可少的，以熟悉的攝像系統(tǒng)的基本操作。 它通常是有益的新手開(kāi)始試成像一個(gè)相對(duì)容易的標(biāo)本，而不是一個(gè)更困難的實(shí)驗(yàn)之一。 一些更好的測(cè)試樣品包括紙浸泡在一種或多種熒光染料或制劑的熒光珠。 這兩種類型的試件是明亮的熒光，并相對(duì)容易的圖像與一個(gè)共聚焦系統(tǒng)。 另一個(gè)出色的樣品混合花粉，表現(xiàn)出許多不同波長(zhǎng)的自發(fā)熒光的載玻片。 這些都可以從花粉從園林植物收集容易地制備，或可以由生物標(biāo)本的商業(yè)供應(yīng)商獲得。 圖4中的花粉粒圖像同時(shí)收集具有相同的PMT中的黑電平與增益和針孔直徑設(shè)置，但揭示了三種類型的花粉，每個(gè)熒光在不同的激發(fā)波長(zhǎng)。 這些樣品是作為測(cè)試對(duì)象有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈儾粌H有一些有趣的表面細(xì)節(jié)，但也保持它們的特性相對(duì)較好，當(dāng)暴露于激光束。 對(duì)于活組織試驗(yàn)，標(biāo)本洋蔥上皮或自來(lái)水廠伊樂(lè)藻準(zhǔn)備。 是可靠的，無(wú)論是使用自體熒光或染色DiOC6。

在嘗試成像，共聚焦儀器應(yīng)設(shè)置以獲得最佳的性能。 這需要最佳比對(duì)，特別是當(dāng)正在使用的舊的共聚焦顯微鏡中的一個(gè)。 使用的對(duì)齊程序是非常具體到特定儀器，通常最好誰(shuí)擁有維護(hù)它總負(fù)責(zé)人完成的。 在任何情況下，應(yīng)調(diào)整嘗試，而不從顯微鏡的所有者適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和權(quán)限。程序不當(dāng)用于嘗試調(diào)整可能會(huì)導(dǎo)致在梁完全喪失，可以在某些儀器的情況下，需要服務(wù)的訪問(wèn)整頓。

共聚焦系統(tǒng)是基于傳統(tǒng)的光學(xué)儀器和光學(xué)顯微鏡的基本程序和做法應(yīng)遵循在任何時(shí)候。 所有玻璃表面的光路是干凈的，因?yàn)榛覊m，油或載玻片上，蓋玻片和物鏡潤(rùn)滑脂差圖像的一個(gè)主要原因，是極其重要的。 物鏡和試樣之間的折射率必須適合于所使用的透鏡。 例如，正確的浸油必須用于一個(gè)給定的物鏡的數(shù)值孔徑，以及檢體必須被安裝成可在透鏡的工作距離范圍內(nèi)。蓋玻片厚度必須正確的鏡片使用，特別是對(duì)于較高功率的物鏡，這需要1號(hào)或第1.5蓋玻片代替2號(hào)蓋玻片必須密封，用適當(dāng)?shù)?a title='介質(zhì)' target='_blank' class='seolabel'>介質(zhì)中的滑動(dòng)，以及安裝持平。 指甲油可用于固定標(biāo)本如果小心以確保它是干燥前成像。 凡士林，蜂蠟，和羊毛脂，或一些其它無(wú)毒密封材料的混合物，必須使用與活標(biāo)本。 以下嚴(yán)格基本清潔度程序在試樣準(zhǔn)備階段可以節(jié)省大量時(shí)間和努力之后。

在準(zhǔn)備共聚焦成像模式，感興趣區(qū)域位于要么使用明或常規(guī)熒光顯微鏡。 優(yōu)選做使用共聚焦系統(tǒng)的顯微鏡本調(diào)查中，但它可以是非常困難的新手找到單獨(dú)使用共聚焦成像模式下的正確焦平面。 如果傳統(tǒng)的成像模式不可用共聚焦系統(tǒng)上，那么感興趣的結(jié)構(gòu)，可以使用單獨(dú)的熒光顯微鏡的位置，并且使用在顯微鏡，記號(hào)筆菱形標(biāo)記標(biāo)明其位置，或者通過(guò)記錄位置從顯微鏡坐標(biāo)階段。 它是特別有用的，以便能夠在嘗試圖像時(shí)罕見(jiàn)的現(xiàn)象來(lái)預(yù)覽標(biāo)本共聚焦系統(tǒng)的實(shí)際顯微鏡如表達(dá)處于發(fā)展中含有可能數(shù)百個(gè)不同年齡的胚胎的檢體的特定階段的基因。 大量的時(shí)間可以被保存在通過(guò)這種方式，在具有掃描使用共聚焦模式許多標(biāo)本。 共聚焦器械通常具有低分辨率快速掃描模式，使初步掃描更有效。 搜尋在很少發(fā)生的事件時(shí)，最好的方法，但是，是用傳統(tǒng)的顯微鏡模式來(lái)掃描載玻片，然后立即切換到共聚焦模式在相同的顯微鏡，收集的圖像。

成功的共聚焦成像依賴于掌握物鏡的數(shù)值孔徑，針孔大小和圖像的亮度之間的相互作用，并且使用最低的激光功率能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的圖像的“秘密”。 新手用戶應(yīng)該嘗試使用試驗(yàn)片和不同的放大倍率及數(shù)值孔徑的多個(gè)物鏡企圖對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本攝像之前獲得的顯微鏡的能力的意義上改變這些參數(shù)。 比較應(yīng)用共聚焦系統(tǒng)具有較高的數(shù)值孔徑獲得的那些使用物鏡的變焦功能獲取的圖像。 特定樣品和特征被成像將確定哪個(gè)鏡片和方法是最合適的。 適合于共聚焦顯微鏡的多物鏡的兩個(gè)例子示于圖5中的數(shù)據(jù)包括一個(gè)60倍平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡油浸鏡頭，和一個(gè)20倍平場(chǎng)螢石。后者的物鏡有一個(gè)調(diào)整軸環(huán)，允許它與油，甘油，或水被用作浸沒(méi)介質(zhì)。

適當(dāng)?shù)臋z體的特定顯微鏡的設(shè)置應(yīng)設(shè)置遠(yuǎn)離感興趣的主要區(qū)域，以避免在熒光物質(zhì)中的檢體的有價(jià)值區(qū)域的光漂白。 通常這需要設(shè)置在光電倍增管檢測(cè)器的增益和黑電平一起針孔尺寸，以獲得可接受的分辨率和足夠的對(duì)比度之間的最佳平衡，使用最低的激光功率可以最小化光漂白。 許多儀器利用設(shè)計(jì)中設(shè)置正確的動(dòng)態(tài)范圍的圖像，以幫助顏色查找表。 這樣的表被設(shè)計(jì)成使最暗像素，在零附近具有亮度值，被任意地顯示為綠色（例如），和最亮的像素，鄰近255中的8位系統(tǒng)的亮度值，顯示為紅色。 顯微鏡參數(shù)，例如增益和黑電平及針孔的直徑，被調(diào)整，使得只有幾個(gè)綠色和紅色的像素的圖像中，以確保全動(dòng)態(tài)范圍從0到255被利用，但是幾乎沒(méi)有截止時(shí)亮度范圍的任一端。 雖然這些調(diào)整可以通過(guò)眼制成，在成像系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍的極端的使用偽使得調(diào)整更主觀的。 在某些情況下，圖像必須被收集在低于該系統(tǒng)的全部動(dòng)態(tài)范圍，因?yàn)樾∮谧罴鸭す夤β?，必須使用或檢體有不均勻的熒光，導(dǎo)致亮區(qū)域掩蓋調(diào)光區(qū)域即在幀的興趣。

在掃描過(guò)程中的檢體的圖像平均化例程通常用來(lái)減少?gòu)臋z測(cè)系統(tǒng)中的隨機(jī)噪聲并增強(qiáng)常數(shù)（非隨機(jī)）的特征在圖像中。 圖像均衡算法可以采集圖像之后被應(yīng)用于它們擴(kuò)展到顯示器的整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍。 應(yīng)小心不要施加這種類型的常規(guī)的，如果是向進(jìn)行，除非一個(gè)控制圖像被包含在相同的幀作為實(shí)驗(yàn)圖像均衡例程之前被施加熒光強(qiáng)度的測(cè)量。 在使用任何類型的圖像處理程序，這是一個(gè)很好的策略，以節(jié)省原材料未處理圖像之外的任何處理的。

在圖像采集通常的策略是保存圖像到共聚焦系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)的硬盤(pán)上，以后將它們備份到其他大容量存儲(chǔ)設(shè)備。 一般情況下，始終是最好收集盡可能多的影像盡可能顯微鏡會(huì)話期間，并在以后查看舍棄不必要的。 許多圖像，似乎沒(méi)有必要為第一考慮成為非常有價(jià)值的，在經(jīng)過(guò)進(jìn)一步審查（尤其是一個(gè)人的同齡人）晚些時(shí)候。 如果它似乎浪費(fèi)采取看似多余的圖像，認(rèn)為它更難制備另一樣品，并且更難重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的確切條件，或甚至精確復(fù)制試樣制備協(xié)議。

成像開(kāi)始之前的策略在一個(gè)信息的方式標(biāo)注圖像文件應(yīng)該得到發(fā)展。 在成像許多音符應(yīng)采取或添加到圖像文件連同該圖像如果這種能力是可用的用于在系統(tǒng)上。 測(cè)試應(yīng)該做的，以確保任何保存的信息是保存圖像，同時(shí)要注意文本和相關(guān)的圖像等信息時(shí)，它隨后被轉(zhuǎn)移到諸如NIH圖像或Adobe Photoshop在其他圖像編輯程序，可能會(huì)丟失后訪問(wèn)計(jì)算機(jī)。 一個(gè)組織良好的筆記本或膝上型計(jì)算機(jī)文件可能是優(yōu)選的過(guò)記錄成像會(huì)議細(xì)節(jié)等手段，并應(yīng)包括文件名，注釋和物鏡的詳細(xì)信息和用于允許計(jì)算比例尺在稍后的日期任何縮放因子。 大多數(shù)共聚焦系統(tǒng)并不自動(dòng)記錄中使用的物鏡，并且該信息是用于計(jì)算場(chǎng)寬度和比例尺購(gòu)買(mǎi)出版物重要。 許多現(xiàn)代系統(tǒng)利用該組織的文件名和文件位置的圖像數(shù)據(jù)庫(kù)，并且，通常將顯示的圖像的縮略圖文件。 必須小心遵循由系統(tǒng)所施加的圖像命名限制，諸如在文件名允許的字符的數(shù)目和是否字符，如時(shí)間或空間可能被軟件被曲解。

故障排除

在任何實(shí)驗(yàn)學(xué)科，已產(chǎn)生良好效果的協(xié)議有時(shí)會(huì)莫名其妙地停止工作。 當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，有可能是一個(gè)初始反射責(zé)怪工具，而不是標(biāo)本，但測(cè)試應(yīng)該進(jìn)行，以確認(rèn)該標(biāo)本是沒(méi)有過(guò)錯(cuò)的任何故障排除是開(kāi)始在儀器前。 一個(gè)很好的第一次測(cè)試是查看在常規(guī)落射熒光顯微鏡的樣品。 如果某些熒光是由眼可見(jiàn)，信號(hào)應(yīng)該是非常光明的正常運(yùn)轉(zhuǎn)的共聚焦系統(tǒng)。 經(jīng)證實(shí)，熒光存在于樣品，然后應(yīng)使用已知的測(cè)試樣品而非實(shí)驗(yàn)之一來(lái)完成的共聚焦系統(tǒng)的一些試驗(yàn)。 為了參考的目的，共聚焦系統(tǒng)應(yīng)具有試樣用戶可獲得的顯微鏡，包括其收集的所有參數(shù)，例如激光功率，針孔的直徑，物鏡和變焦值，增益和圖像的數(shù)字文件黑電平檢測(cè)器的。

如果最初的測(cè)試不提供明確的解決方案，最好是尋求誰(shuí)可能之前都經(jīng)歷過(guò)這個(gè)問(wèn)題的專家的幫助。 作為一項(xiàng)規(guī)則，如果用戶不知道的東西，它是最好的，他們退后一步，嘗試任何補(bǔ)救措施之前尋求幫助。 所有供應(yīng)共聚焦顯微鏡的公司有熱線電話和網(wǎng)站，可以獲取更多幫助來(lái)訪問(wèn)。

被追蹤到的制備協(xié)議問(wèn)題通常由試劑的降解引起的，這應(yīng)該通過(guò)執(zhí)行一系列的診斷測(cè)試來(lái)檢查。 它通常是可取的做實(shí)驗(yàn)的人，以彌補(bǔ)他們自己的試劑，或至少?gòu)目尚磐芦@得它們。 抗體應(yīng)該從冷凍的儲(chǔ)存在小批量進(jìn)行分配，然后在冷藏下保存，并且不應(yīng)該被重復(fù)使用，除非絕對(duì)必要的。 有時(shí)，這是不可避免的稀有或昂貴的試劑，而且往往不存在的一個(gè)問(wèn)題。

在與多標(biāo)記標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)中，滲出通過(guò)從一個(gè)信道到另一個(gè)可發(fā)生作為檢體自身的特性的結(jié)果，或者由于出現(xiàn)問(wèn)題的顯微鏡。 發(fā)表評(píng)論文獻(xiàn)應(yīng)征詢的出血，經(jīng)過(guò)和可能的補(bǔ)救措施的原因的詳細(xì)信息。 儀器本身的一個(gè)很好的測(cè)試涉及測(cè)試樣品與已知的滲出通過(guò)屬性的成像，同時(shí)使用多標(biāo)簽和單標(biāo)簽設(shè)置。 試樣的圖像應(yīng)與所有相關(guān)的顯微鏡設(shè)置的記錄被存儲(chǔ)沿，以便當(dāng)確實(shí)發(fā)生的問(wèn)題的試驗(yàn)片可以重新成像的相同的儀器條件和圖像相比與存儲(chǔ)的當(dāng)儀器被稱為記錄要優(yōu)化運(yùn)行。

出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可進(jìn)行其他測(cè)試包括激光照明的顏色的視覺(jué)檢查和激光的陽(yáng)極電壓的檢查。 如果，例如，一個(gè)多標(biāo)簽設(shè)置在掃描時(shí)從氪/氬激光光束出現(xiàn)的白藍(lán)代替那么這可能表明該紅線較弱。 在這種情況下，陽(yáng)極電壓可能會(huì)過(guò)高，并且通?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整激光的反射鏡被減少到可接受的水平。 這種調(diào)整應(yīng)做通過(guò)，或通過(guò)，負(fù)責(zé)維護(hù)的共聚焦系統(tǒng)的人員的監(jiān)督。 如果電壓不能被帶進(jìn)可接受的范圍內(nèi)時(shí)，可能需要替換為激光。（奧林巴斯顯微鏡）

可能遇到的另一個(gè)問(wèn)題是，抗體探針可能具有劣化或需要進(jìn)行再純化或以其它方式清潔。 已經(jīng)制備了一段時(shí)間的標(biāo)本可能發(fā)展增加背景熒光和滲出通過(guò)引起從二次抗體分離并擴(kuò)散到周圍組織的熒光。如果可能的話，成像應(yīng)進(jìn)行對(duì)新制備的試樣。有時(shí)改變濃度和/或熒光染料的分布將有助于緩解問(wèn)題。作為一個(gè)例子，熒光素可能出血進(jìn)入羅丹明信道，并且可以被切換，使得羅丹明是強(qiáng)信道上。這樣做的理由是，該熒光激發(fā)光譜具有一個(gè)尾部重疊帶而被激發(fā)的羅丹明波長(zhǎng)范圍。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，次級(jí)的濃度可以降低。

圖像處理和公布

用共聚焦顯微鏡獲得的圖像通常被保存為一個(gè)格式，允許他們使用提供作為共聚焦系統(tǒng)的一部分的專用軟件很容易地操縱計(jì)算機(jī)數(shù)字文件。對(duì)當(dāng)前的LSCMs最顯著改善性能的共聚焦圖像的顯示。這是非常重要的，因?yàn)槭褂玫墓簿劢癸@微鏡中的成像的改進(jìn)的小值，如果沒(méi)有辦法有效地顯示圖像或再現(xiàn)它們作為硬拷貝。

就在最近的5年左右前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍使用傳統(tǒng)攝影暗房和膠片和紙張的化學(xué)處理圖像的最終硬拷貝。有再現(xiàn)彩色圖像特別的困難，因?yàn)樗麄兺ǔＳ瑟?dú)立的打印機(jī)，誰(shuí)往往有什么構(gòu)成的顯微正確的色彩平衡和質(zhì)量打印的成本是很高的小主意打印。為了獲得圖像的硬拷貝現(xiàn)在，圖像文件可以導(dǎo)出到載玻片打印機(jī)，彩色激光打印機(jī)，或染料熱升華打印機(jī)出版質(zhì)量的打印，可直接控制圖像特征由誰(shuí)收購(gòu)人維持圖像。的照片打印或載玻片可以直接從視頻監(jiān)視器屏幕進(jìn)行拍攝，并且電影序列可以在網(wǎng)絡(luò)上公布。

大部分期刊現(xiàn)在能夠接受的數(shù)字圖像文件的出版物，這導(dǎo)致了在公開(kāi)的圖像的質(zhì)量的顯著改善。通過(guò)共聚焦成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了圖像質(zhì)量，現(xiàn)在可以更加真實(shí)地再現(xiàn)發(fā)表的文章。在某些情況下，雜志也使可在CD-ROM，這意味著讀者可以訪問(wèn)發(fā)布的圖像，正是因?yàn)樗麄兂霈F(xiàn)時(shí)，這些做研究的共聚焦系統(tǒng)收集他們的文章。不令人驚訝地在圖像采集，顯示，和公布的技術(shù)進(jìn)步是在彩色圖像中該雜志現(xiàn)在可以準(zhǔn)確地再現(xiàn)圖像與它們的原始分辨率和顏色平衡的情況下尤其有利，從理論上說(shuō)，在低得多的成本給作者。