徠卡顯微鏡動(dòng)態(tài)超分辨率顯微鏡
超分辨率顯微鏡技術(shù)徹底改變了生物學(xué)，因?yàn)樵谶^(guò)去十年。 在他們的幫助細(xì)胞組分現(xiàn)在可以在蛋白質(zhì)的大小可視化。 然而，成像活細(xì)胞是對(duì)于大多數(shù)的超分辨率的原則是一個(gè)挑戰(zhàn)。 在這方面，一個(gè)名為uPAINT（通用積分累積成像納米級(jí)地形）技術(shù)抓住了關(guān)注。 此單分子方法利用連續(xù)標(biāo)記，任意生物分子膜的動(dòng)態(tài)成像在活細(xì)胞中以非常高的密度以顯示超分辨的圖像和單個(gè)分子的軌跡。
定位顯微鏡
例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技術(shù)基于時(shí)間去相關(guān)的熒光。 通過(guò)實(shí)現(xiàn)分離的分子“發(fā)射，隨后將其定位與subdiffraction精度可以用來(lái)重建超分辨的圖像。 為了使這些方法來(lái)工作，視場(chǎng)內(nèi)的分子的絕大多數(shù)必須處于非發(fā)光狀態(tài)。
為了實(shí)現(xiàn)熒光發(fā)射的時(shí)間分離，制定了幾種方法：
STORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡）方法，通過(guò)將大多數(shù)人口的進(jìn)入一個(gè)黑暗的狀態(tài)，具有高功率激光照明的幫助下實(shí)現(xiàn)單分子的時(shí)間分辨熒光.為了使這種方法的工作樣品必須被嵌入在氧化或還原緩沖劑以穩(wěn)定的熒光團(tuán)的斷開狀態(tài)。 隨機(jī)的分子的一個(gè)亞群逸出從暗狀態(tài)和發(fā)出熒光。 這種“對(duì)速度”可以是微調(diào)由圍繞標(biāo)本和照明與第二激光（405納米）的解決方案，它減少了在關(guān)閉狀態(tài)的壽命。
PALM（圖片激活定位顯微鏡）技術(shù)采用光活化/敞篷熒光蛋白，可以“變身”開和關(guān)。激活后，他們進(jìn)行成像，直到他們漂白。 在這種情況下，激活光源的強(qiáng)度決定了熒光激活率。
用定位顯微鏡技術(shù)的幫助下，一個(gè)子衍射分辨率達(dá)到和細(xì)胞組分可在前所未有的細(xì)節(jié)進(jìn)行可視化。 然而存在用于這些類型的方法實(shí)現(xiàn)，即天然蛋白質(zhì)的超分辨圖像上活細(xì)胞的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。
當(dāng)研究人員要求，研究?jī)?nèi)源性蛋白在高密度在活細(xì)胞中，無(wú)論是STORM 也PALM技術(shù)完美地完成所有必需的前提條件。在基于STORM的情況下，接近降低成像緩沖區(qū)與活細(xì)胞不兼容。 PALM又取決于遺傳修飾的嵌合光活化的熒光蛋白質(zhì)的利用率，從而內(nèi)源性蛋白不能被觀察到。
通用積累點(diǎn)成像的納米地形（uPAINT）是一個(gè)復(fù)雜的技術(shù)規(guī)避這些問(wèn)題。它的工作原理是動(dòng)態(tài)成像單分子軌道上下偏斜照明細(xì)胞表面，因此導(dǎo)致在超分辨的天然生物分子的行為的跟蹤，在活細(xì)胞的表面上。
相比之下，傳統(tǒng)的定位顯微鏡方法，其利用用于成像的分子的一小部分隨機(jī)的熒光發(fā)射，uPAINT由成像低濃度的熒光配體，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合，并與它們的靶相互作用的小光量?jī)?nèi)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的時(shí)間分離。
該uPAINT原則
通用PAINT追溯到原來(lái)的做法稱為漆 （點(diǎn)積累的成像納米拓樸圖）。用于此目的的熒光標(biāo)記的探針擴(kuò)散在溶液中，并開始在結(jié)合到感興趣的對(duì)象，以發(fā)出熒光。阿列克謝Sharanov和Robin Hochstrasser通過(guò)連續(xù)靶向脂質(zhì)雙層和大單層囊泡與尼羅紅是不發(fā)熒光的水溶液而開始發(fā)熒光在疏水環(huán)境中引入這種方法。在水中快速分子擴(kuò)散導(dǎo)致尼羅紅的恒定通量在膜的附近。隨后出現(xiàn)從它進(jìn)入膜的時(shí)刻的熒光信號(hào)。在這種新的環(huán)境探測(cè)成為熒光和流動(dòng)性急劇下降，使得其檢測(cè)帶攝像頭（幾毫秒），直到光漂白發(fā)生。 通過(guò)確定每個(gè)單獨(dú)的熒光信號(hào)，大約分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持續(xù)時(shí)間插入（毫秒）就不可能追蹤單個(gè)分子在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的行為。（奧林巴斯顯微鏡）
后來(lái)格雷戈里Giannone和Eric Hosy重點(diǎn)，克服一些原漆技術(shù)的局限性。 通過(guò)使用特定的熒光配體（即抗體）代替非特異性膜染料，單，特定蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)成像成為可能。由于更廣泛的應(yīng)用帶寬，這種方法被命名為通用PAINT。
對(duì)于這種技術(shù)背景未結(jié)合標(biāo)記的配體存在于培養(yǎng)基中的熒光，通過(guò)使用斜光 （圖1）克服。從轉(zhuǎn)移其預(yù)期使用TIRF激光是關(guān)鍵。發(fā)送激光略低于臨界角向載玻片導(dǎo)致了“ 高度傾斜和層壓光學(xué)片 ”（HILO）傾斜穿過(guò)試樣的形成。 本卷中只有熒光很興奮。
低濃度的標(biāo)記的配體加入到介質(zhì)洗澡的檢體內(nèi)部的緩沖器。布朗擴(kuò)散導(dǎo)致配體在細(xì)胞表面的連續(xù)和隨機(jī)結(jié)合到它們的目標(biāo)。希洛光路內(nèi)只熒光很興奮和成像（圖1）。
A） B）
圖。1：uPAINT原則。 A）徠卡SR GSD 3D提供了機(jī)會(huì)，調(diào)整激光束的滲透角度。 與它的TIRF（全內(nèi)反射熒光）照明可以實(shí)現(xiàn)，如果該激光打玻璃滑動(dòng)標(biāo)本相間超越所謂臨界角θ
與此相反，以用于涂料脂質(zhì)探針的相對(duì)較短和插入依賴性熒光，從用于uPAINT配位體的信號(hào)通過(guò)光漂白的染料，而不是配體解離速率的主要是限制。
因此，結(jié)合的配體的運(yùn)動(dòng)可以被跟蹤和記錄有子衍射分辨率。隨后的數(shù)據(jù)分析和重建的配位體的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致所謂的軌跡，表示他們的路線。由于大量的數(shù)據(jù)可以被收集，關(guān)于配位體'的速度，分娩，簇組織等統(tǒng)計(jì)信息可以被提取，例如，研究膜受體在突觸（圖2）。
A） B） C） D）
圖2：在不同的步驟uPAINT成像。 A） 轉(zhuǎn)染與突觸標(biāo)記荷馬-GFP神經(jīng)元的落射熒光細(xì)節(jié)（勾勒的單元格）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獲得的單個(gè)圖像的 B） 為例。 綁定到其目標(biāo)結(jié)構(gòu)以及四個(gè)孤立的單一熒光配體（ATTO 647）（未指定）。 每個(gè)粒子將是超本地化通過(guò)計(jì)算（像素大小為160nm）。C）過(guò)度積累的所有單顆粒本地化的。 亮像素對(duì)應(yīng)于樹枝狀（象素尺寸20納米）。D） 的 個(gè)別蛋白質(zhì)的軌跡的高度參觀的地方。 每種顏色對(duì)應(yīng)一個(gè)粒子的旅程。
各種生物問(wèn)題可以探討與uPAINT。 由此，各熒光探針具有仔細(xì)根據(jù)不同的用途來(lái)進(jìn)行選擇。例如，以到達(dá)受限制的地區(qū)，小的探針如Tris NTA-ATTO或Fab片段可以用（約2納米以記錄長(zhǎng)的軌跡，多耦合抗體是優(yōu)選的。有趣的是，即使單個(gè)分子的FRET實(shí)驗(yàn)可以開發(fā)
總之uPAINT不僅產(chǎn)生超分辨的圖像，但也提供了超分辨上在活細(xì)胞中的單，具體的，膜結(jié)合的生物分子的動(dòng)態(tài)信息。 而相比之下，傳統(tǒng)的定位顯微鏡技術(shù)，uPAINT規(guī)避有害緩沖劑或遺傳修飾的蛋白的用途，并相應(yīng)地使鄰近的自然條件下，觀察
所述uPAINT技術(shù)的一個(gè)限制是，它被限制為質(zhì)膜結(jié)合的分子的研究。因?yàn)闊晒鈽?biāo)記的抗體，不能穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞質(zhì)膜，這是不可能用uPAINT來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)。
uPAINT與徠卡SR GSD 3D
徠卡SR GSD 3D提供了兩種基本的操作模式：落射熒光和全內(nèi)反射熒光照明。 對(duì)于TIRF（全內(nèi)反射熒光）照明的照明器的TIRF準(zhǔn)直的激光束到蓋玻璃，含有在水溶液中的檢體。 如果激光束超過(guò)臨界角，以該玻璃滑動(dòng)水相間，發(fā)生全反射。在同一時(shí)間的漸逝波傳播入試樣在玻璃載片的另一側(cè)。 其刺入深度可以從80至250納米通過(guò)傾斜角度的激光被操縱。 漸逝場(chǎng)內(nèi)部?jī)H熒光團(tuán)將被激發(fā)，產(chǎn)生了非常好的信噪比。 出于這個(gè)原因的TIRF照明是優(yōu)選的技術(shù)觀察近質(zhì)膜過(guò)程（圖1）。
通過(guò)移動(dòng)激光入射低于臨界角時(shí)，它把載玻片，并隨后照射試樣傾斜。 裝置只有樣品的一小部分是由激發(fā)光照亮。 在此所謂的HILO獲取的圖像（高傾斜和層疊光學(xué)片）模式顯示出低背景和良好的信噪比。 此外漂白和光毒性可以降低用這種方法得到的在延長(zhǎng)的細(xì)胞生存力（圖1）。
在實(shí)踐中的Leica SR GSD 3D提供了兩種不同的工作模式下工作的激光束的TIRF分別HILO照明（見圖3）。
自動(dòng)模式可以選擇預(yù)定義的穿透深度逐步介于80和250納米。此外，漸逝場(chǎng)（方位角）的方向可以以四種不同的方式來(lái)確定。
在專家模式允許自由選擇的穿透深度的漸逝場(chǎng)的移動(dòng)的綠色區(qū)域內(nèi)的滑動(dòng)件（見圖3）。超出綠區(qū)的激光超過(guò)臨界角，并開始以誘導(dǎo)HILO偏斜照明。
A） B） C）
圖3：自動(dòng)與專家模式：穿透深度和激發(fā)激光束的方位可以由成像軟件控制。 A）自動(dòng)模式使從80到250納米加上四個(gè)不同的消逝場(chǎng)方向選擇的穿透深度的消逝場(chǎng)逐步的。 B）專家模式可以設(shè)置的穿透深度無(wú)級(jí)采用了滑蓋。 綠化面積標(biāo)志著TIRF區(qū)。 C）把滑塊出綠色TIRF區(qū)達(dá)到HILO照明。
對(duì)于一個(gè)uPAINT實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)在玻璃底室的細(xì)胞應(yīng)覆蓋有非熒光介質(zhì)（離子溶液如臺(tái)氏培養(yǎng)基）并置于顯微鏡。在明模式搜索細(xì)胞后可以識(shí)別并專注于觀察一個(gè)有趣的領(lǐng)域。隨后在顯微鏡必須被切換到GSD模式，正確的濾波器立方體和激光必須選擇。 現(xiàn)在，專家模式有助于找到HILO照明的正確設(shè)置（見上文）。 注意該滑塊和該激光的滲透角的依次位置取決于單元厚度。 事后熒光團(tuán)偶聯(lián)的抗體或配體，必須向培養(yǎng)基中加入。在隨后的采集僅熒光團(tuán)結(jié)合到相關(guān)抗原在細(xì)胞膜會(huì)發(fā)出熒光。 由于偏斜照明，未結(jié)合的配體將不會(huì)被激發(fā)，從而防止它們的漂白和降低噪音水平。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，質(zhì)膜蛋白的恒定標(biāo)簽可以被成像。 原始數(shù)據(jù)文件隨后可被用于重建的本地化和單個(gè)分子中的超分辨率的動(dòng)態(tài)變化。
uPAINT實(shí)驗(yàn)有時(shí)需要長(zhǎng)采集周期（幾十秒）來(lái)揭示感興趣幾乎所有蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)和組織。在這種情況下，漂移可以通過(guò)圖像圖像檢測(cè)珠的位置（FE TetraSpeck TM）的修正。 收購(gòu)?fù)瓿珊?，徠卡SR GSD 3D軟件能夠通過(guò)珠的本土化自動(dòng)重新定位每個(gè)圖像。研究納米團(tuán)簇例如，當(dāng)這種漂移校正模式是必不可少的。
總括而言，徠卡SR GSD 3D提供不同的照明方案。 它原來(lái)的用途是做下TIRF或落射熒光照明dSTORM / GSDIM超分辨率顯微鏡。此外，HILO照明可以進(jìn)行的，必需的uPAINT。因而兩者，蛋白質(zhì)靜態(tài)以及動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)可以收集與一個(gè)顯微鏡使該組織的超分辨檢查外加蛋白質(zhì)的內(nèi)源性水平在活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)。