光學(xué)結(jié)構(gòu)的寬光譜劃歸審議過(guò)程中儀器開(kāi)發(fā)的全內(nèi)反射熒光顯微鏡檢查（TIRFM）的早期階段。從這一努力出現(xiàn)一個(gè)數(shù)字，滿(mǎn)足在不同折射率的兩種材料之間的接合處產(chǎn)生的薄漸逝場(chǎng)的要求設(shè)計(jì)的。
在倒置顯微鏡下為這些設(shè)計(jì)的大部分，主要是由于添加TIRFM光學(xué)上的方便，而不是下面，笨重的顯微鏡臺(tái)。立式顯微鏡的結(jié)構(gòu)也可以利用，尤其是當(dāng)這是唯一可行的選擇，實(shí)驗(yàn)條件或調(diào)查員的預(yù)算。與生長(zhǎng)的細(xì)胞在單層培養(yǎng)在塑料培養(yǎng)皿底細(xì)胞基質(zhì)接觸的觀察是一種直立顯微鏡很好的候選人，尤其是當(dāng)與浸漬的錐體采用水浸的物鏡。倒置顯微鏡更有效時(shí)，檢查細(xì)胞或膜組件連接到一個(gè)密封的標(biāo)本室上部或當(dāng)物鏡是用來(lái)照亮和檢索從試樣的二次熒光發(fā)射。
無(wú)論基本的顯微鏡的設(shè)計(jì)，大多數(shù)目前使用的TIRFM結(jié)構(gòu)依賴(lài)增加棱鏡激光直接光照往何處發(fā)生全內(nèi)反射界面，這是樣品中的共聚焦平面的顯微鏡。也可以用顯微鏡物鏡的同時(shí)直接照射到接口和實(shí)現(xiàn)第二熒光發(fā)射的激發(fā)熒光基團(tuán)產(chǎn)生。本文討論了許多的TIRFM基本的顯微鏡的結(jié)構(gòu)，并假定例標(biāo)本是在組織培養(yǎng)中的一個(gè)或多個(gè)熒光染料標(biāo)記，在單層附著在玻璃蓋玻片在全內(nèi)反射界面生長(zhǎng)的細(xì)胞。
圖1中給出的是一個(gè)典型的TIRFM儀器結(jié)構(gòu)涉及一個(gè)倒置的組織培養(yǎng)顯微鏡，梯形棱鏡塊，外加激光照明，和一個(gè)光電倍增管/ CCD探測(cè)器系統(tǒng)的組合。發(fā)出的激光經(jīng)過(guò)先擴(kuò)束后成一個(gè)分束器將顯微鏡入口端口和梁主任鏡之間的淡藍(lán)色的光。在導(dǎo)演的鏡面反射，光的一部分被聚焦透鏡到梯形棱鏡放置在顯微鏡載物臺(tái)上方的標(biāo)本室和物鏡集中。棱鏡把光照在一個(gè)角度，略大于內(nèi)部全反射的臨界角的TIRF接口，創(chuàng)建一個(gè)漸逝場(chǎng)激發(fā)熒光的樣品。光的分束器通過(guò)另一部分進(jìn)入顯微鏡的港口，在那里它可以被引導(dǎo)通過(guò)光培養(yǎng)寬視場(chǎng)落射熒光激發(fā)試樣。二次熒光的樣品發(fā)射的物鏡是收集并傳遞到目鏡的CCD攝像系統(tǒng)，光電倍增管（PMT），或。由于梯形棱鏡的頂是平的，從鎢鹵素光源照明可以用來(lái)觀察樣品在透射模式使用一系列的對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)，包括微分干涉相襯，相對(duì)比，暗視野，和霍夫曼調(diào)制對(duì)比度。
當(dāng)設(shè)計(jì)TIRFM實(shí)驗(yàn)，在構(gòu)型的主題考慮的最重要的因素是照明的臨界角。普通的玻璃蓋玻片上，在組織培養(yǎng)細(xì)胞通常生長(zhǎng)，有約1.52的折射率的介質(zhì)時(shí)，周?chē)募?xì)胞和細(xì)胞內(nèi)成分的折射率的范圍從1.33到1.38。因此，在細(xì)胞膜和蓋玻片之間的接口獲得全內(nèi)反射（N（2）／n（1）＝1.52／1.38），入射角必須大于65度的臨界角。如果細(xì)胞是不完整的和已透，溶血，超聲處理，或固定，然后低折射率的水性緩沖液（N（1）= 1.33）而不是細(xì)胞質(zhì)，和臨界入射角度減少到61度。
奧林巴斯顯微鏡在原則上，可以采用傳統(tǒng)的鹵鎢或汞/氙弧燈進(jìn)行技術(shù)試驗(yàn)，但大多數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道的調(diào)查是在激光照射下進(jìn)行。激光器是如此廣泛的首選的最主要的原因是，激光是相干光，偏振，和準(zhǔn)直，這樣就可以很容易地引導(dǎo)到物鏡或棱鏡擴(kuò)束鏡，使用標(biāo)準(zhǔn)，和聚焦透鏡。當(dāng)激光源是正確對(duì)齊，全內(nèi)反射界面被定義的幾何形狀，可以很容易地調(diào)整，以適應(yīng)變化的區(qū)域試驗(yàn)。高強(qiáng)度的激光源，也為實(shí)驗(yàn)要求的照明相當(dāng)重要，如熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）的調(diào)查和熒光比率測(cè)定。
為tirmf實(shí)驗(yàn)最流行的激光源是1至3瓦的空氣和水冷卻的連續(xù)波氬離子系統(tǒng)，在488和514納米，具有很強(qiáng)的發(fā)射線，提供廣泛的普通熒光激發(fā)的能力。在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)具有線激光器，如氦、氖、氪離子氣體激光器，可用于激發(fā)熒光團(tuán)的吸收在540納米和較高的地區(qū)。然而，幾乎所有的激光在0.5瓦的總可見(jiàn)輸出或更大的范圍應(yīng)該足夠了。激光源是一般可取為T(mén)IRFM弧燈，因?yàn)樵趶?qiáng)度嚴(yán)重降低電弧燈發(fā)出的光準(zhǔn)直的結(jié)果。然而，激光照射有不可避免的干擾邊緣上的試樣，可以通過(guò)精心清洗光學(xué)表面有所降低。臨界實(shí)驗(yàn)，研究者應(yīng)該探索快速抖動(dòng)的激光束，或至少計(jì)算一個(gè)正常的使用由一個(gè)均勻的熒光團(tuán)的濃度控制的數(shù)字圖像樣本的數(shù)字圖像。
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)
為了實(shí)現(xiàn)在倒置顯微鏡下培養(yǎng)室全內(nèi)反射的激光直接照射在玻璃立方體放置在腔室頂部的最簡(jiǎn)單的方法，如圖2所示。在一般情況下，一個(gè)固定的顯微鏡（物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)/物鏡組合是翻譯在聚焦）比移動(dòng)臺(tái)顯微鏡更方便。這種結(jié)構(gòu)使試件將聚焦的過(guò)程中保持靜止，只需要對(duì)激光束的初始對(duì)準(zhǔn)。然而，移動(dòng)臺(tái)顯微鏡是更常見(jiàn)的，兩種類(lèi)型可用于這些實(shí)驗(yàn)。
在倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是在這里，緩沖區(qū)填充的樣品室由一個(gè)較低的赤裸的蓋玻片，60微米厚的聚四氟乙烯墊片環(huán)，和細(xì)胞粘附蓋玻片倒使細(xì)胞的臉朝向物鏡。這種設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞沒(méi)有綁定到基板，松散的細(xì)胞碎片，和污染蛋白傾向于沉積物作為一個(gè)集合到室底無(wú)遮蔽或添加外源熒光全內(nèi)反射界面。
單層細(xì)胞的蓋玻片組合的上表面被放置在與玻璃塊光接觸（或棱鏡）由一層薄薄的浸油或甘油的方法。玻璃塊的側(cè)面應(yīng)固定，但樣品必須能夠接受的翻譯在x和y方向的同時(shí)仍然保持光學(xué)接觸。下蓋可以過(guò)大和聚四氟乙烯墊片通常是有差距，緩沖溶液浸泡的細(xì)胞可通過(guò)毛細(xì)管作用具有入口和出口端口（圖2和圖3）。一些制造商提供的組織培養(yǎng)室是專(zhuān)為這個(gè)物鏡。
如圖2所示，激光光束首先進(jìn)入一個(gè)聚焦透鏡傾斜放置在顯微鏡載物臺(tái)。鏡頭的物鏡是將激光照射在幾乎相同的方式，作為一個(gè)物鏡在EPI照明，但鏡頭也更容易對(duì)準(zhǔn)的窄波束寬度。透鏡的焦距是不重要的，50和100毫米之間的范圍，但應(yīng)允許研究者很容易改變照明面積的大小在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)。在照明系統(tǒng)其他組件，聚焦透鏡應(yīng)安裝在一個(gè)軸與入射激光束方向?qū)?zhǔn)X-Y-Z翻譯。譯者可以安裝在實(shí)驗(yàn)室的工作臺(tái)上或顯微鏡的階段，但會(huì)更容易使當(dāng)它被安裝在舞臺(tái)上。
三個(gè)主要的光學(xué)元件和直接控制激光束的大小和途徑進(jìn)入聚焦透鏡之前（見(jiàn)圖1）。這些包括擴(kuò)束器拓寬激光光束在退出腔，一個(gè)分束器（可選）或反射鏡，和一個(gè)光束導(dǎo)演將光束聚焦到聚焦透鏡。
激光光束擴(kuò)展器的廣泛可用一些經(jīng)銷(xiāo)商，并用于在聚焦透鏡的光束寬度控制。作為一個(gè)結(jié)果，然后通過(guò)聚焦透鏡確定收斂到樣品與焦斑寬度角。激光光折射在一系列的光束角遇到的立方體的垂直面時(shí)。由此產(chǎn)生的幾何畸變的界面處產(chǎn)生一個(gè)橢圓的照射區(qū)域，這是拉長(zhǎng)時(shí)相比，一個(gè)高斯分布的平行光束的預(yù)期模式。梁是更大的當(dāng)他們進(jìn)入聚焦透鏡產(chǎn)生具有較薄的尺寸反射點(diǎn)。在最佳條件下，梁的半寬度接近下限可以達(dá)到2.5μm。
分束器是一面鏡子，把水平激光束在垂直方向（90度角）來(lái)提升它的過(guò)去的高度的顯微鏡載物臺(tái)和玻璃棱鏡或塊。一個(gè)可調(diào)節(jié)的光學(xué)安裝應(yīng)該用來(lái)房子分束器可移除以允許激光直接進(jìn)入一個(gè)快速和可逆轉(zhuǎn)換為輔助外延照明顯微鏡端口。利用部分鍍銀鏡或甚至一個(gè)普通的載玻片作為分束器，兩個(gè)落射照明和全內(nèi)反射可以同時(shí)查看。
梁主任鏡采用角的激光束從垂直方向斜向聚焦透鏡（見(jiàn)圖1）。鏡子高度在全內(nèi)反射面確定入射角。除了線性調(diào)節(jié)高度，導(dǎo)演鏡子應(yīng)該裝在一個(gè)雙軸旋轉(zhuǎn)安裝允許的未聚焦的激光束方向進(jìn)入棱鏡。如果鏡像安裝連接到移動(dòng)臺(tái)顯微鏡階段（而不是實(shí)驗(yàn)室），的反射區(qū)的位置可以被聚焦時(shí)，試樣的變化不敏感。
正確對(duì)齊時(shí)，準(zhǔn)直和聚焦的激光束進(jìn)入玻璃立方體，而導(dǎo)演折射罷工的全內(nèi)反射界面（在立方體的下表面）與入射角超過(guò)臨界最小。無(wú)論是規(guī)模還是的立方體形狀是至關(guān)重要的，和棱鏡或長(zhǎng)方形的玻璃塊可以很容易地取代。等邊45-45-90-degree棱鏡是標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)項(xiàng)目，可以從各種來(lái)源購(gòu)買(mǎi)。一個(gè)平頂棱鏡（圖2和圖4），如立方體上面或截?cái)嗟娜切?，使鹵鎢燈和聚光系統(tǒng)在棱鏡安置。在這種結(jié)構(gòu)中，傳統(tǒng)照明技術(shù)如明場(chǎng)，暗場(chǎng)，相襯，和微分干涉對(duì)比可以耦合TIRFM調(diào)查協(xié)助確定的熒光源于界面的空間位置。
安裝的棱鏡或玻璃塊，將一滴純甘油或浸油的文化室的上表面和棱鏡慢慢降低到油面，從而傳播的液滴成薄薄的一層。接觸媒體（甘油或油）有兩個(gè)物鏡：保證棱鏡和樣品室之間的光學(xué)接觸，和機(jī)械潤(rùn)滑區(qū)的兩個(gè)玻璃表面之間。隨著標(biāo)本室側(cè)翻譯在掃描過(guò)程中，棱鏡或玻璃塊是固定的。入射的激光束傳播通過(guò)棱鏡的斜下方，然后通過(guò)甘油或油層，最后通過(guò)試樣，完全反映在基板的底面直接在顯微鏡的光軸。基板的厚度是不重要的，除了厚的基板（那些接近一個(gè)毫米甚至更多）可能會(huì)限制激光束從會(huì)議的底面直接在顯微鏡的光學(xué)軸。
浸泡接觸的介質(zhì)（油或甘油）應(yīng)謹(jǐn)慎使用，因?yàn)槿魏味嘤嗟目赡芊e聚在棱鏡的下邊緣和干擾入射激光照明時(shí)，首先進(jìn)入玻璃。棱鏡的大小并不重要，但是大棱鏡可以抑制試樣的橫向運(yùn)動(dòng)，雖然會(huì)增加浸泡介質(zhì)珠和入射光束之間的間隙。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)棱鏡或玻璃塊與約一平方厘米面積是理想的。
棱鏡采用幾個(gè)令人興奮的激光系統(tǒng)不需要在折射率精確匹配的幻燈片或蓋玻片中發(fā)生全內(nèi)反射。他們可能與甘油，環(huán)己醇的光耦合，或顯微鏡浸油，其他光不同的液體。浸沒(méi)油具有較高的折射率，這有助于避免在棱鏡/耦合在低入射角的媒體接口可能全內(nèi)反射。然而，許多品牌的浸油表明自體熒光顯著量。另外重要的一點(diǎn)是，截?cái)嗬忡R表面不需要特殊的拋光處理，但與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)顯微鏡載玻片平滑充分履行。
幾個(gè)樣品室的設(shè)計(jì)，利用由玻璃和/或蓋玻片窗口如圖3所示。左側(cè)（圖3（a））是一個(gè)塔姆室內(nèi)設(shè)計(jì)提供一種薄的輪廓，使組織培養(yǎng)的細(xì)胞是通過(guò)一層薄的緩沖溶液中觀察到的，它允許高數(shù)值孔徑的物鏡有很短的焦距的使用。一個(gè)單層的細(xì)胞上生長(zhǎng)，蓋玻片（或顯微鏡），是從一個(gè)具有厚度小于100微米的薄墊片下蓋玻片分離。接入孔，使細(xì)胞與各種各樣的溶液進(jìn)行滴定灌流，平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)，或在細(xì)胞表面相互作用的動(dòng)力學(xué)分析。一個(gè)類(lèi)似的裝置，該德沃夏克史托勒控制的環(huán)境中培養(yǎng)室，是說(shuō)明了在圖4（b）。該室還利用蓋玻片兩個(gè)頂部和底部的窗口，但不能訪問(wèn)孔或任何機(jī)制來(lái)允許添加化學(xué)品或緩沖溶液的變化。
如圖3所示，標(biāo)本室包含必要的維持培養(yǎng)細(xì)胞的水性緩沖液。這個(gè)解決方案是夾在襯底表面和蓋玻片之間，相隔一氯丁橡膠或聚四氟乙烯墊片。聚四氟乙烯環(huán)是市售的，具有的厚度范圍從50微米以上。緩沖溶液的深度必須相當(dāng)薄，如果高放大倍率的物鏡具有大的數(shù)值孔徑和短的工作距離是被雇用。在許多情況下，該玻璃棱鏡在基板上的向下的壓力可能是適當(dāng)?shù)拿芊鈽悠肥覠o(wú)附加卡，但許多室內(nèi)設(shè)計(jì)（圖3）包括安全機(jī)制的基板和玻璃蓋玻片。
在情況下，一個(gè)棱鏡法（而不是一塊玻璃）實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射（見(jiàn)圖4（a）），最大入射角是通過(guò)引入激光束從水平方向上得到的。標(biāo)準(zhǔn)玻璃（有1.52個(gè)折射率），最大入射角為73度的直角棱鏡和79度的等邊棱鏡。由于三角棱鏡上表面不平坦的相位對(duì)比度和其他的透射光技術(shù)不采用這種結(jié)構(gòu)兼容。然而，自定義截?cái)嗪屠忡R的頂拋光（顯示如圖4一個(gè)選項(xiàng)（A））產(chǎn)生的表面，可以很容易地通過(guò)入射的光從上面通過(guò)倒置顯微鏡聚光系統(tǒng)。
安裝在顯微鏡聚光鏡單元時(shí)，一個(gè)60度的梯形棱鏡（圖4（b））是最方便和可重復(fù)配置開(kāi)發(fā)的TIRFM以上倒儀器階段。入射的激光束是垂直的，所以全內(nèi)反射面積變化的橫向一個(gè)很小的程度時(shí)，棱鏡提高和relowered在試樣的變化。此外，傳統(tǒng)的透射光技術(shù)（相對(duì)比，明暗，等）與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兼容。由于入射角固定為60度（1.52，普通光學(xué)玻璃的折射率）是不能夠支持全內(nèi)反射，并具有高折射率棱鏡是必需的。用燧石玻璃制成的棱鏡（折射率為1.64）將符合這些要求，與市售。光束將折射遠(yuǎn)離正常的從通過(guò)棱鏡到蓋玻片的69度的角度，從而超過(guò)臨界角在蓋玻片/緩沖或蓋玻片/細(xì)胞界面。與墻為45和60度之間的梯形是理想的，但這些單位是不容易的，必須生產(chǎn)出定制規(guī)格。不幸的是，45或60度的梯形也沒(méi)有市售，但他們可以通過(guò)截?cái)嗪蛼伖獾氖惺鄣娜抢忡R的頂點(diǎn)的廉價(jià)生產(chǎn)。
圖5給出了四分之一的結(jié)構(gòu)利用一個(gè)拋物面反射鏡和半球形棱鏡進(jìn)行倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)。在本設(shè)計(jì)中，反射鏡和棱鏡的位置使激光束穿過(guò)一個(gè)半徑的棱鏡對(duì)全內(nèi)反射靶區(qū)在凹面鏡的焦點(diǎn)。因?yàn)楣饩€進(jìn)入棱鏡幾乎正常在所有的入射角在臉上，光束輪廓的像差相比，與一個(gè)立方體或矩形棱柱塊所觀察到的減少。在垂直入射激光束的橫向偏移能總是把焦點(diǎn)放在同一個(gè)地方，使大量的、方便的改變光線入射角。此外，在漸逝場(chǎng)的干涉條紋，可以通過(guò)將輸入光束分成兩個(gè)組件創(chuàng)建的，每個(gè)反射在拋物線一個(gè)單獨(dú)的方位角位置，但重組在拋物面焦點(diǎn)。條紋間距可以通過(guò)調(diào)整兩個(gè)入射光束的相對(duì)方位角位置的變化，和非常高的空間頻率可以達(dá)到。干涉條紋，可以作為一種輔助聚焦的接口上創(chuàng)建一個(gè)平行線的干涉條紋圖案。這一模式可以在細(xì)胞/襯底接觸的區(qū)域觀察到的，這證實(shí)了激勵(lì)源的倏逝場(chǎng)（而不是通過(guò)細(xì)胞場(chǎng)隨機(jī)散射光）。干擾模式也是有用的在表面的擴(kuò)散速率的研究來(lái)衡量的接觸區(qū)域的膜元件的橫向流動(dòng)。盡管這個(gè)設(shè)計(jì)的通用性（圖5），定位是非常困難的，該系統(tǒng)是更敏感的振動(dòng)。
倒置顯微鏡結(jié)構(gòu)審查這里都有一些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。主要的優(yōu)點(diǎn)是能夠利用而廉價(jià)的光學(xué)顯微鏡工作臺(tái)上有足夠的空間位置的試樣和玻璃塊/棱鏡和支撐光學(xué)元件。此外，棱鏡可以安裝在聚光鏡支架（安置在現(xiàn)代倒置顯微鏡階段）在升降自如，并與傳統(tǒng)的光學(xué)技術(shù)輔助觀察。最后，這些光學(xué)安排享受簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)和最容易對(duì)準(zhǔn)的全內(nèi)反射系統(tǒng)。
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)主要缺點(diǎn)之一是事實(shí)，標(biāo)本不易從上面和常規(guī)照明由棱鏡先端阻礙訪問(wèn)。同時(shí)，最短的工作距離的物鏡不可能達(dá)到聚焦在緩沖層，并具有高數(shù)值孔徑的物鏡圖像質(zhì)量的降低由于球面像差時(shí)，觀察樣品在較厚的緩沖層。
棱鏡或玻璃塊對(duì)齊的倒置顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)涉及到對(duì)全內(nèi)反射區(qū)直接在物鏡而試樣在焦點(diǎn)。第一步是將樣品室和棱鏡組合，然后將試件在使用明場(chǎng)照明的重點(diǎn)（甚至在棱鏡的頂點(diǎn)是存在的）。接下來(lái)，用激光聚焦透鏡的光束直接刪除，以便它經(jīng)過(guò)的物鏡前透鏡中心的全內(nèi)反射。這可以通過(guò)直接觀察（不通過(guò)顯微鏡目鏡）用于散射入射光在棱鏡，浸層，和基板。重新插入聚焦透鏡后聚焦的激光束，使進(jìn)入棱鏡側(cè)面大約一毫米的底部邊緣以上調(diào)整其位置。直接觀看梁應(yīng)在棱鏡底部顯示的散射光三共線性點(diǎn)：兩個(gè)在外面，光束通過(guò)浸漬層，和一個(gè)中央地方的光束經(jīng)過(guò)在試樣內(nèi)部全反射。聚焦透鏡應(yīng)調(diào)整中間點(diǎn)是可見(jiàn)的細(xì)長(zhǎng)圓柱面。和全內(nèi)反射區(qū)域大小的位置可以用聚焦透鏡的翻譯和移動(dòng)透鏡的縱向優(yōu)化照明區(qū)域的尺寸調(diào)整。
的全內(nèi)反射區(qū)的形狀依賴(lài)的棱鏡或玻璃塊側(cè)表面的取向，在激光束進(jìn)入。如果一邊是垂直的（如在一塊或矩形），該地區(qū)將長(zhǎng)到一定程度，是一個(gè)電子束會(huì)聚功能。正如前面所討論的，延伸率是由于像差的大折射角度首先介紹了棱鏡表面或玻璃塊。另一方面，如果側(cè)面傾斜使準(zhǔn)直的激光束進(jìn)入一個(gè)角度接近垂直，然后反射區(qū)會(huì)像一個(gè)小的細(xì)長(zhǎng)的圓錐形部分，預(yù)計(jì)從切片的圓柱形束在一個(gè)角。
在所有上述的光學(xué)結(jié)構(gòu)，照亮的區(qū)域?qū)⒈３制椒€(wěn)的視場(chǎng)中心作為試樣在橫向尺寸掃描。然而，當(dāng)顯微鏡階段期間移動(dòng)焦點(diǎn)，照亮的區(qū)域可以橫向移動(dòng)作為樣本集中，取決于是否聚焦透鏡和光束的導(dǎo)演都安裝在實(shí)驗(yàn)室的工作臺(tái)上或顯微鏡階段。
全內(nèi)反射點(diǎn)的重點(diǎn)應(yīng)不大于視場(chǎng)寬度。如果現(xiàn)場(chǎng)太大，假散射和離焦熒光從棱鏡和蓋玻片之間的浸油層會(huì)增加其他熒光背景低，可能與全內(nèi)反射熒光顯微鏡。另一個(gè)工件時(shí)的入射角非常接近臨界最小，表現(xiàn)為沿界面的表面細(xì)胞明顯的陰影。這可以通過(guò)一定的入射角超過(guò)臨界角數(shù)度，避免。
當(dāng)入射角接近臨界值，有時(shí)很難確定是否已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了全內(nèi)反射。在這種情況下，通過(guò)顯微鏡目鏡觀察熒光強(qiáng)度?？蓭椭芯空叽_定儀器的正確結(jié)構(gòu)。從TIRF界面熒光發(fā)射是從由入射光束在亞臨界“略讀”的角度通過(guò)緩沖水傳播的激發(fā)截然不同。因?yàn)橘渴挪ǎú幌窆馐鴤鞑ィ┦沁h(yuǎn)小于的重點(diǎn)物鏡深度，熒光似乎來(lái)源于由全內(nèi)反射的激發(fā)單平面。相反，落射照明（從亞臨界梁）激發(fā)熒光團(tuán)在標(biāo)本室和二次熒光大部分是在很寬的范圍內(nèi)的焦平面的觀察。
局部定性強(qiáng)度測(cè)量在總的內(nèi)部反射的實(shí)驗(yàn)，這可能是可取的限制區(qū)，從收集的發(fā)射光。經(jīng)常被照射區(qū)域是不可能很小，但確定的表面積可以通過(guò)一個(gè)可調(diào)光闌放置在發(fā)射光通路的圖像平面上獲得。
另外幾個(gè)TIRFM結(jié)構(gòu)涉及倒置顯微鏡已被聘用的人員。該系統(tǒng)如圖6所示提供了另一個(gè)系統(tǒng)，固定棱鏡相對(duì)于試樣代替激光束。雷射光從右邊進(jìn)入通過(guò)一個(gè)入口的棱鏡，并折射到基板上傳播朝向顯微鏡光軸通過(guò)多次內(nèi)部反射。一路上，多重反射光束遇到標(biāo)本（組織培養(yǎng)細(xì)胞粘附在玻璃蓋玻片）說(shuō)明了發(fā)色團(tuán)在玻璃/緩沖界面區(qū)。通過(guò)試件和基板后，反射光束進(jìn)入射棱鏡，它將光從實(shí)驗(yàn)。在這種結(jié)構(gòu)中，光照反射區(qū)將試樣時(shí)，翻譯。
一個(gè)更有用的結(jié)構(gòu)，是兼容的同時(shí)注射或膜片鉗實(shí)驗(yàn)，如圖7所示。為了提供從上面一個(gè)組織文化沐浴在緩沖容易和連續(xù)訪問(wèn)，棱鏡是部署下階段接觸玻璃基板。這種結(jié)構(gòu)，不可用于所有倒置顯微鏡，受到嚴(yán)密的幾何因?yàn)槲镧R也居住在鄰近地區(qū)。如系統(tǒng)如圖6所示，臺(tái)下的棱鏡啟動(dòng)多個(gè)總的內(nèi)部反射在蓋玻片，這將激勵(lì)光波導(dǎo)的遠(yuǎn)軸的視場(chǎng)的中心。
在最簡(jiǎn)單的形式中，一個(gè)小三角棱鏡（商用）放置，通過(guò)浸泡油或甘油，與含有細(xì)胞和緩沖液蓋底光接觸。樣品可以翻譯而棱鏡保持橫向固定，雖然涂抹油可以在蓋玻片可以摧毀第一反射下側(cè)左（實(shí)驗(yàn)）。一個(gè)可行的方法是使用一個(gè)額外的干預(yù)蓋玻片與光學(xué)透明膠固定到棱鏡。滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)發(fā)生的干預(yù)和細(xì)胞的蓋玻片蓋玻片之間，這是光學(xué)接觸，由一層薄薄的潤(rùn)滑油或甘油浸泡。這種結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要缺點(diǎn)是，油或甘油浸漬物鏡無(wú)法使用，因?yàn)榻萁橘|(zhì)可能會(huì)破壞內(nèi)部反射照明斑的形成之前。然而，空氣（干）或水浸的物鏡很好地工作在這種情況下。
直立顯微鏡結(jié)構(gòu)
梯形棱鏡，類(lèi)似于圖4所示（B），可以安裝在聚光鏡支架在直立顯微鏡在位于階段標(biāo)本全內(nèi)反射界面觀察現(xiàn)象（圖8）。擴(kuò)展的激光束被引入到顯微鏡基地使用用于發(fā)射光源相同的端口（這應(yīng)該被刪除）。一個(gè)長(zhǎng)的焦距（約250毫米）會(huì)聚透鏡放在門(mén)口附近的港口和安裝在X-Y翻譯用于聚焦入射激光束和允許的橫向位置微調(diào)。激光準(zhǔn)直照明可以利用顯微鏡內(nèi)置的光學(xué)列車(chē)直梁通過(guò)底座和垂直向上進(jìn)入棱鏡。一個(gè)額外的鏡頭位置略高于顯微鏡基礎(chǔ)往往是翻譯和焦點(diǎn)的全內(nèi)反射點(diǎn)有用的。這種結(jié)構(gòu)不調(diào)整入射角提供了很大的靈活性，但有限的范圍內(nèi)的值可以通過(guò)使用具有不同的角的幾何形狀和折射率達(dá)到幾個(gè)梯形。圖像是通過(guò)冷卻科學(xué)CCD數(shù)碼相機(jī)在圖5所示的收集，但一個(gè)光電倍增管或雪崩光電二極管可以很容易地取代。
棱鏡玻璃折射率的選擇是有限的要求，用火石玻璃（折射率為1.62）是優(yōu)選的配方。一個(gè)60度的入射角，棱鏡的折射率必須至少1.53為全內(nèi)反射發(fā)生在玻璃/水界面（無(wú)論基板材料）。這就是為什么火石玻璃，而不是普通的光（皇冠）玻璃或石英，是這些實(shí)驗(yàn)的理想的棱鏡材料。
照明光被反射到棱鏡的顯微鏡鏡下，并透過(guò)玻璃折射棱鏡的角邊。因?yàn)樘菪卫忡R將自定義尺寸沒(méi)有市售，菱形截面是由截?cái)嗪蛼伖庥|手可及的等邊三角形的棱鏡上制作。聚焦透鏡后的激光軌跡定位，這是調(diào)整的傾斜側(cè)和朝向的上表面在60度的入射角進(jìn)入棱鏡中心在全內(nèi)反射的底部。當(dāng)聚焦透鏡插入光路，光束遵循相同的過(guò)程，但更薄、更強(qiáng)烈的。
標(biāo)本室，這可能是一個(gè)塑料培養(yǎng)皿或培養(yǎng)皿，置于顯微鏡下觀察期。一小滴浸介質(zhì)（甘油或油）放置在棱鏡上，并由聚光器齒條機(jī)構(gòu)提高帶來(lái)的文化室的下表面的光學(xué)接觸。然后是激光束的聚焦透鏡位置譯者調(diào)整內(nèi)部全反射在燃燒室的上表面（或基片）和遵循一個(gè)對(duì)稱(chēng)的過(guò)程返回在棱鏡對(duì)面鏡座。此設(shè)置適用于許多類(lèi)型的基板，但特別適合觀察細(xì)胞在塑料培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)。然后，細(xì)胞可以被視為在該室最初被播種后沒(méi)有重新安裝步驟。在一個(gè)直立顯微鏡觀察試樣使研究者同時(shí)探測(cè)細(xì)胞微量移液器，片夾，和注射器，提供物鏡有足夠的工作距離。
二次熒光發(fā)射可以通過(guò)干燥，收油，或水浸物鏡（調(diào)遷后的大部分緩沖）通過(guò)蓋玻片，懸浮的細(xì)胞單層表面上方間隔。另外，一個(gè)傾斜的錐水浸物鏡可以直接放置到緩沖溶液浸泡的細(xì)胞。直立顯微鏡結(jié)構(gòu)是非常方便的，因?yàn)闃悠房梢曰Q，因?yàn)樗麄兒苋菀着c標(biāo)準(zhǔn)照明系統(tǒng)。的TIRF照明區(qū)域的位置也通過(guò)固定和不受影響的，即使在移動(dòng)臺(tái)顯微鏡，占絕大多數(shù)的現(xiàn)代正立顯微鏡設(shè)計(jì)。主要的缺點(diǎn)是沒(méi)有切換到另一個(gè)棱鏡具有不同的傾斜角度的入射光角度不可調(diào)。
一個(gè)直立的系統(tǒng)提供了高質(zhì)量的圖像水浸時(shí)的物鏡是潛到直接通過(guò)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)室的緩沖溶液中圖像的細(xì)胞，但結(jié)構(gòu)是否存在幾個(gè)缺點(diǎn)。許多用于培養(yǎng)容器結(jié)構(gòu)的聚合物制劑有一定程度的熒光，這可能會(huì)降低弱熒光樣品的對(duì)比。這種效應(yīng)可以復(fù)合如果浸耦合介質(zhì)不慎重選擇。浸泡油的幾個(gè)商業(yè)品牌也顯示熒光在不同層次，調(diào)查員警告檢查浸入油和塑料培養(yǎng)器皿潛在的熒光效應(yīng)在使用它們之前的TIRFM實(shí)驗(yàn)。不同品牌的組織培養(yǎng)塑料在顯示在激發(fā)自體熒光的量有顯著的變化。
棱鏡，滑動(dòng)窗口和蓋玻片，室，可以在大多數(shù)應(yīng)用普通火石光學(xué)玻璃制成的，除非短穿透深度從高折射率產(chǎn)生所需的。光學(xué)玻璃不透光的低于約310納米，也有一個(gè)較長(zhǎng)的衰減時(shí)間，昏暗的光反射，可以在一些漂白實(shí)驗(yàn)問(wèn)題。高質(zhì)量的自發(fā)光的熔融二氧化硅（石英）要低得多。更奇特的高折射率的材料，如藍(lán)寶石，二氧化鈦，鈦酸鍶，不會(huì)受到高水平的熒光產(chǎn)量漸逝場(chǎng)的穿透深度超過(guò)比光波長(zhǎng)低一個(gè)數(shù)量級(jí)。
熒光檢測(cè)
不同的共聚焦和多光子顯微鏡，許多TIRFM圖像可以被記錄在電影中的方式類(lèi)似的顯微鏡，在很大程度上依賴(lài)攝影經(jīng)典形式（明場(chǎng)，暗場(chǎng)，微分干涉相襯，，等）。在某些情況下，尤其是當(dāng)只有幾個(gè)熒光標(biāo)本中存在的，最好是使用更敏感的成像設(shè)備，如強(qiáng)度增強(qiáng)的冷卻CCD攝像機(jī)，科學(xué)，雪崩光電二極管，或光電倍增管。時(shí)間推移cinemicrography也有可能在TIRFM實(shí)驗(yàn)，和圖像幀序列可以與任何上述設(shè)備拍攝，其中選擇將取決于二次熒光強(qiáng)度和暴露時(shí)間獲取圖像。豐富的熒光樣品可以記錄在膠片上（或單獨(dú)一幀序列），但圖像采集與視頻或CCD攝像機(jī)是目前硬件現(xiàn)成的調(diào)查人員更方便。
通用性大量時(shí)提供的圖像獲取與光電倍增管或雪崩光電二極管。光電倍增管通常采用空間懸而未決但快速檢測(cè)和熒光強(qiáng)度的定量分析。可變孔和/或圖像平面膜片（以上）使研究者可以選擇性地捕獲的完全可用字段的部分。這是有用的當(dāng)長(zhǎng)的采樣間隔在低光照水平是必要的，或只有部分的視場(chǎng)的興趣。光電倍增管的光譜特性，應(yīng)當(dāng)選擇一個(gè)圖像采集裝置的考慮，這些應(yīng)該被檢查的熒光團(tuán)的發(fā)射特性一致。
結(jié)論
在一般情況下，全內(nèi)反射更難在顯微鏡由于激光束的焦點(diǎn)調(diào)整需要調(diào)整到顯微鏡的焦平面與光軸移動(dòng)階段已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)選擇一個(gè)顯微鏡技術(shù)研究，注重機(jī)械穩(wěn)定性和樂(lè)器的結(jié)構(gòu)基序。倒置或直立顯微鏡在隔離表一個(gè)沉重的框架將使研究者建立脆弱的漸逝場(chǎng)的相對(duì)振動(dòng)自由的環(huán)境。聚焦激光照射源保持在幾微米的范圍內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間是困難的（最好的），但可以通過(guò)當(dāng)顯微鏡，激光光源，并支持光學(xué)元件固定在適當(dāng)?shù)陌惭b和牢固地固定在工作臺(tái)或顯微鏡階段。
廣泛的顯微鏡物鏡的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)兼容技術(shù)。唯一的絕對(duì)的要求是，物鏡有足夠長(zhǎng)的工作距離觀察接口在緩沖溶液的墊片厚度薄差距的定義。聚四氟乙烯和氯丁橡膠墊片可以比任何標(biāo)準(zhǔn)的物鏡工作距離較薄，同時(shí)仍然比漸逝場(chǎng)的穿透深度大得多。這減少了無(wú)法專(zhuān)注于接口的可能性，但并不能彌補(bǔ)潛在的畸變，在樣品/緩沖區(qū)的折射率變化引起的。在大多數(shù)高放大倍率的物鏡的球面像差校正的關(guān)鍵取決于試樣被立即在蓋玻片的遠(yuǎn)側(cè)，而不是在一個(gè)額外的薄水層。結(jié)果可以是一個(gè)圖像對(duì)比度不足，產(chǎn)生朦朧的形象甚至當(dāng)銳聚焦。物鏡規(guī)范沒(méi)有一般的規(guī)則可以提供，但水浸的物鏡（或浸漬或那些需要蓋玻片）可能是最好的（也是最貴）的選擇。另一方面，TIRFM實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功地進(jìn)行了與幾乎所有市售的數(shù)值孔徑和放大的物鏡。
在許多研究，它是理想的快速開(kāi)關(guān)的照明之間的界面的全內(nèi)反射和更深入地滲透到試樣的體積由經(jīng)典的落射熒光照明。作為一個(gè)例子，一個(gè)短暫的過(guò)程中可能涉及的同時(shí)，但有些不同，在膜和細(xì)胞質(zhì)的變化，兩者都必須被記錄。專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的光電系統(tǒng)，利用聲光調(diào)制器由若干研究已經(jīng)描述了。這些結(jié)構(gòu)是由電腦控制的，通常包含多個(gè)調(diào)制器的行為同步振蕩TIRF和落射熒光寬視野之間的亮度，同時(shí)采集數(shù)據(jù)與光電倍增管和快速響應(yīng)的光電二極管裝置。
玻璃表面支持細(xì)胞的粘附性往往是涂有特定的基板技術(shù)研究。的二氧化硅的表面化學(xué)衍生物可以產(chǎn)生獨(dú)特的物理和化學(xué)吸收特性，在調(diào)節(jié)模型膜和類(lèi)似結(jié)構(gòu)的形成是有用的。此外，某些特定的化學(xué)共價(jià)結(jié)合在細(xì)胞生物學(xué)和生物物理學(xué)是特別有用的。細(xì)胞粘附可通過(guò)附件的多聚賴(lài)氨酸對(duì)玻璃表面增強(qiáng)，和疏水性的表面可以長(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔锏闹|(zhì)單層吸收了。其他有用的分子，可用于治療表面選擇性特異性包括抗體，抗原，平面的磷脂，和外源凝集素。
層鋁?。?0納米的區(qū)域），它可以淬滅熒光，也可以應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)的真空蒸發(fā)玻璃表面。沉積厚度可以通過(guò)完全蒸發(fā)前測(cè)鋁量的精確控制。沉積后，鋁膜的上表面自然氧化物在大氣中產(chǎn)生一層薄薄的鋁氧化物。氧化物涂層膜具有相似的二氧化硅的化學(xué)性質(zhì)，可以衍生的在一個(gè)類(lèi)似于玻璃的方法。一種金屬膜幾乎完全淬火的熒光團(tuán)的熒光在約10納米的能力允許從標(biāo)記的蛋白質(zhì)的非特異性吸附到襯底的信號(hào)抑制。這發(fā)生在允許從更遙遠(yuǎn)的標(biāo)記的蛋白質(zhì)吸附到附著膜熒光。
不同的共聚焦顯微鏡的光學(xué)部分，產(chǎn)生排斥的焦點(diǎn)發(fā)出的光與一組的圖像平面針孔光闌，TIRFM是有限的地區(qū)在幾百納米的玻璃/緩沖界面的全內(nèi)反射的發(fā)生。激光共聚焦顯微鏡具有通用性明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楣鈱W(xué)切片的作品在任何平面的試樣并不僅限于不同的折射率之間的接口。然而，TIRFM確實(shí)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括一個(gè)非常薄的光學(xué)部分（約100納米和600納米的共焦），相鄰的界面附近區(qū)域選擇性的照明，并有能力（相對(duì)便宜的）適應(yīng)現(xiàn)有的顯微鏡利用技術(shù)。
