光的吸收差異往往是在活細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞內(nèi)的成分和質(zhì)膜之間可以忽略不計(jì)，使他們幾乎不可見(jiàn)的觀察時(shí)，利用明場(chǎng)照明的經(jīng)典技術(shù)的顯微鏡。相差顯微鏡利用微小的折射率的差異在細(xì)胞成分和未染色的細(xì)胞和其周圍的水溶液中，在這些和類似的透明標(biāo)本產(chǎn)生的對(duì)比。
光通過(guò)環(huán)孔或環(huán)，安裝在聚光器焦平面，用以照亮在常規(guī)相襯顯微鏡標(biāo)本（圖1）。為空心圓錐體發(fā)出的光相環(huán)遭遇透明標(biāo)本，它是經(jīng)亞細(xì)胞成分和膜或通過(guò)非偏移。光穿過(guò)標(biāo)本非偏移到戒指形狀的物鏡的后焦平面，而微弱光標(biāo)本衍射分布在焦平面上的整個(gè)表面。一個(gè)小的相移約四分之一波長(zhǎng)相對(duì)于光直接測(cè)量在光誘導(dǎo)的試樣衍射。
相位差的光直接從背景和衍射光從樣品使兩束光互相干涉在中間圖像平面。這是通過(guò)添加或減去一個(gè)四分之一波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到直接的光的半透明的相位板放置在一個(gè)平面，共軛手段達(dá)到（物鏡后焦平面）的環(huán)在聚光鏡（聚光鏡前焦平面）。直接的背景光是由一個(gè)中性密度薄膜的物鏡相環(huán)采用衰減。在中間圖像平面，一個(gè)干涉圖案的結(jié)果，產(chǎn)生強(qiáng)度由樣品引起的相位偏移的比例。
在相差顯微鏡一個(gè)不幸的工件是光環(huán)效應(yīng)其結(jié)果，在虛假的亮區(qū)周圍的物體或反相位圖像中的對(duì)比度。這種效果是特別普遍的標(biāo)本，產(chǎn)生大的相移。暈工件減少曾經(jīng)被認(rèn)為是一個(gè)理論難題，但物鏡相環(huán)結(jié)構(gòu)的最新進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致了一種新的技術(shù)稱為變跡相對(duì)比（圖2），它允許有大的相位差來(lái)查看和拍攝的高清晰度和細(xì)節(jié)的定義相對(duì)象結(jié)構(gòu)。
圖2給出了一個(gè)傳統(tǒng)的（或經(jīng)典）和變跡相板定位在一個(gè)角度觀察切片通過(guò)為了便于說(shuō)明中心。左邊的經(jīng)典相位板，位于物鏡后焦面，有一個(gè)薄環(huán)的中性密度材料（稱為相位膜）應(yīng)用于表面（圖1也說(shuō)明）。這部電影的物鏡是延緩直接光線透過(guò)標(biāo)本由四分之一波長(zhǎng)允許建設(shè)與衍射光在中間圖像平面的干擾和破壞階段。圖2右邊的是一個(gè)變跡相板圖。在這個(gè)板塊的周邊相膜是半透明的中性密度材料的兩個(gè)同心區(qū)域，減少?gòu)臉悠吩谛〗嵌妊苌涔獾膹?qiáng)度。變跡相差顯微鏡，這相位板取代了板在物鏡后孔左。
變跡相板在顯微鏡下看到的圖像效果如圖3所示為兩個(gè)標(biāo)本。圖3（a）是一個(gè)照片的海星胚胎與尼康顯微鏡Eclipse E600相襯模式操作標(biāo)準(zhǔn)。其物鏡是使用長(zhǎng)工作距離（隨鉆測(cè)井）PH1 DL（明暗）設(shè)計(jì)生產(chǎn)上的淺灰色背景暗圖像的輪廓。這種類型的物鏡是用于細(xì)胞和其他生物材料的常規(guī)相對(duì)比檢查最流行的類型，因?yàn)樗哂?a title='折射' target='_blank' href='http://http://pooher.com/xinwen/shownews.php?lang=cn&id=740' class='seolabel'>折射率的差異主要對(duì)象產(chǎn)生了強(qiáng)烈的明暗對(duì)比。注意周圍的胚胎的外周和對(duì)比度和圖像細(xì)節(jié)的細(xì)胞團(tuán)中央部分缺失的光環(huán)。一個(gè)顯著的改善對(duì)比度是一個(gè)具有切趾相位板相應(yīng)的物鏡觀察使用，如圖3所示（B）。在這張圖中，海星胚胎有顯著減少暈周圍和具有鋒利的邊緣增強(qiáng)的內(nèi)部樣本的細(xì)節(jié)和明顯的景深。
一雙類似的照片是在圖3所示（C）和3（D），用活眼蟲(chóng)標(biāo)本。眼蟲(chóng)屬的原生動(dòng)物順序Euglenida成員，單細(xì)胞生物的一個(gè)顯著的組，其中許多展品的植物和動(dòng)物的特征。圖3（c）提出了一個(gè)經(jīng)典的相位對(duì)比圖像的眼蟲(chóng)標(biāo)本采用DL階段物鏡。內(nèi)部樣本的細(xì)節(jié)有一個(gè)模糊的對(duì)比度和外細(xì)胞膜包圍的巨大光環(huán)。當(dāng)同一標(biāo)本采用變跡相光學(xué)（圖3（d）），減少暈的大小和內(nèi)部樣本特征更高分辨。
變跡相對(duì)比理論
折射率（N）大多數(shù)位相物體，尤其是活細(xì)胞，范圍1.36和1.37之間的照射時(shí)，具有平均波長(zhǎng)的光集中在可見(jiàn)光譜區(qū)（550納米）。有一個(gè)球形的幾何形狀的試樣，試樣和周圍介質(zhì)隨試樣厚度的增加之間的相位差，導(dǎo)致偏離的標(biāo)本的光一個(gè)較小的衍射角。假設(shè)一個(gè)球形試樣，最大相位差（δ）和直徑（D）由以下方程：
(1)
在λ是光在真空中的波長(zhǎng)（或空氣），N’是樣品的折射率，和N是周圍介質(zhì)的折射率（通常是一個(gè)緩沖水溶液）。這是明顯的從方程，增加試樣的直徑（D）將非法相應(yīng)較大的相位差（δ）在照明的波前，提供的樣品和媒體的折射率保持不變。
現(xiàn)在，我們將考慮的圓孔直徑產(chǎn)生的衍射圖案D。在理想的情況下，當(dāng)物鏡是無(wú)像差和提供了一個(gè)統(tǒng)一的圓孔，相鄰的兩個(gè)點(diǎn)是解決當(dāng)他們通風(fēng)盤(pán)中心的距離R，中央艾里斑半徑。數(shù)量R由方程確定：
(2)
在λ是光與空氣的波長(zhǎng)作為浸介質(zhì)和θ是衍射角（角度）。在這個(gè)討論中，我們假設(shè)孔徑D等于分辨率的距離R，然后能狀態(tài)：
(3)
該重排：
(4)
代入方程（1）為方程（4）的收益率：
(5)
(6)
如果衍射角（θ）是小的，然后是長(zhǎng)期之間的反比關(guān)系sin(θ) 和相位差（δ）：
(7)
為了研究衍射和非偏移光強(qiáng)度在中間圖像平面上，我們必須首先考慮照明波前的物理方面。如果照明波前均勻平面波入射波前，然后（φ（0））和波前通過(guò)相位物體后（φ試樣；（1））可以由以下方程描述：
(8)
(9)
在ω為照明波前角頻率，T是時(shí)間，和δ通過(guò)標(biāo)本或通過(guò)周圍介質(zhì)的波陣面之間的相對(duì)相位差。在大多數(shù)情況下，δ小的價(jià)值，所以，方程（9）降低：
(10)
方程中的第一項(xiàng)（10）描述了入射光波（方程（8））和代表衍射或直接光通過(guò)和周圍的標(biāo)本，而第二個(gè)術(shù)語(yǔ)表明筆由標(biāo)本衍射的光線。在大多數(shù)情況下，衍射光有一個(gè)四分之一波長(zhǎng)的相位差相對(duì)于直接光，和幅度，是由樣品引起的相位差成比例的。考慮到加（或減）的四分之一波長(zhǎng)的光的直接部分通過(guò)一個(gè)適當(dāng)?shù)姆謪^(qū)相位板的使用物鏡后焦平面，方程（10）降低：
（11）
到達(dá)強(qiáng)度（I）在中間圖像平面波，我們可以把方程的平方（11）將刪除時(shí)間依賴性：
(12)
圖像強(qiáng)度成正比（1 +δ）2因?yàn)槠椒接嘞曳e分常數(shù)。因此，衍射角之間的關(guān)系，通過(guò)試樣的衍射光的振幅和相位的差異，建立了。從方程（12），這是明顯的，在中間圖像平面上的光的強(qiáng)度是在直接的振幅總和的比例和衍射光。應(yīng)當(dāng)指出的是，衍射光的強(qiáng)度和位置的變化，而光領(lǐng)域，直接在圖像平面均勻。
變跡相板
在實(shí)踐中，暈還原和試樣的對(duì)比度的增加，可以通過(guò)選擇性的幅度利用獲得的過(guò)濾器位于建成的物鏡在后焦平面的相位板相位膜相鄰。這些振幅過(guò)濾器包括中性密度濾光片薄膜應(yīng)用于周圍的相片如圖2所示的相位板。的相移圈在經(jīng)典的相位板的透過(guò)率約為百分之25，而相鄰的環(huán)周圍的相移圈在切趾板對(duì)有透射率為百分之50的中性密度。在兩個(gè)板的相薄膜的寬度是一樣的。這些值的相移薄膜應(yīng)用于相襯顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)板的透射率值一致。
周圍的中性密度薄膜可由衍射角計(jì)算出必要的寬度（θ），討論了方程（2）通過(guò)（7）。這個(gè)值是有些標(biāo)本的依賴，但商業(yè)變跡相物鏡可以從尼康制作假設(shè)一個(gè)對(duì)象（樣本）約10微米的直徑，用于組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)生物細(xì)胞的典型值。
在圖4中給出了變跡相位對(duì)比技術(shù)的基本原理，說(shuō)明了小型和大型標(biāo)本的影響。之間的關(guān)系在不同尺寸的試樣的相位差，嚴(yán)重影響變跡相板衰減的影響。光的衍射的較大的標(biāo)本慷慨的一部分（大于或等于10微米的直徑；圖4（a））通過(guò)中性密度吸收環(huán)和將被衰減，從而降低強(qiáng)度。另一方面，標(biāo)本，直徑小于10微米，如核仁，細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)顆粒，衍射光會(huì)通過(guò)對(duì)中性密度過(guò)濾器的外周由于大的衍射角。在這種情況下，衍射光的振幅將不會(huì)通過(guò)相位板的透明部分的衰減，在高對(duì)比度細(xì)節(jié)渲染標(biāo)本（但伴有暈）。
切趾技術(shù)已與其他的光學(xué)配置成功地用于減少在孔直接光強(qiáng)度。在任何衍射極限的成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，通常有側(cè)裂片或顯著的強(qiáng)度側(cè)環(huán)。這些文物可以設(shè)計(jì)解決弱點(diǎn)光源位于相鄰的一個(gè)強(qiáng)大的點(diǎn)源系統(tǒng)相當(dāng)?shù)年P(guān)注。術(shù)語(yǔ)切趾來(lái)自希臘詞“清除腳”。在光學(xué)方面，“腳”被認(rèn)為是在一個(gè)有限的衍射成像系統(tǒng)的側(cè)裂片或側(cè)環(huán)。類似的技術(shù)，在數(shù)字成像中常用的術(shù)語(yǔ)，是已知的窗口。
一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的變跡要求振幅衰減的介紹（或在某些情況下，增強(qiáng)）光通過(guò)出瞳。的衰減量在瞳孔的中心通常是可以忽略的，但與半徑的增加而增加，成為最大的在附近的孔徑瞳孔邊緣。換句話說(shuō)，在孔徑圖像的邊緣可以“軟化”的光衰減面膜的介紹。因?yàn)樵谶吘壊ㄆ鹪从谶吘壨蝗豢讖窖苌涞慕Y(jié)果，軟化效應(yīng)有助于傳播的衍射波明顯起源地區(qū)較廣。這個(gè)結(jié)果在抑制振鈴效應(yīng)的邊緣波。
切趾的經(jīng)典被用來(lái)提供一個(gè)逐漸變細(xì)的透射率接近光通過(guò)為光學(xué)系統(tǒng)的出瞳來(lái)抑制旁瓣的周圍的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的邊緣強(qiáng)度。然而近年來(lái)，切趾，已經(jīng)應(yīng)用到其他系統(tǒng)，用來(lái)描述任何引進(jìn)吸收入瞳，無(wú)論旁瓣抑制或雜音。
總之，變跡相對(duì)比的結(jié)果在顯著提高光學(xué)圖像的利用率，減少了暈和微小的標(biāo)本細(xì)節(jié)對(duì)比度高。在大多數(shù)情況下，亞細(xì)胞的功能（如核仁）可以明確區(qū)分為暗對(duì)比與已切趾的物鏡，但這些特點(diǎn)有明亮的光環(huán)或成像為亮點(diǎn)，使用傳統(tǒng)的相位對(duì)比光學(xué)。與切趾光學(xué)，對(duì)比是扭轉(zhuǎn)由于衍射光的相對(duì)大的振幅，直接光線透過(guò)標(biāo)本。
從相位物體圖像的對(duì)比度可以通過(guò)調(diào)整透光率和環(huán)形中性密度區(qū)圍繞中心相薄膜尺寸的改變。如果這些區(qū)域與梯度的透射率產(chǎn)生，然后對(duì)象的對(duì)比可以為各種不同的試樣尺寸更緊密的控制。
