徠卡顯微鏡EM ACE600電子束
甘油噴霧/低角度旋轉遮蔽是在生物學用于可視化的結構，得到與其他技術不足等相反，制劑技術，由于其直徑小。此方法通常用于標本，其中包括與卷曲螺旋結構域或DNA的蛋白質。
樣品制備包含三個步驟:首先,標本的小水滴懸浮在一個緩沖區(qū)包含30%甘油和乙酸銨緩沖噴灑到新鮮貼近,干凈的云母片表面。 第二步,樣品轉移到高真空蒸發(fā)器:這個工具允許存款薄層的電子致密物質(通常是Pt、W或非盟)在低角度到樣品。 蒸發(fā)物質積累主要在提高樣本,從而提供了對比。 隨后,一層支持C是蒸發(fā)到標本提供支持。 在第三步中,副本形成脫離的云母和安裝到EM電網教具電子顯微鏡檢查。
徠卡EM ACE600配備Pt / C和C電子束蒸發(fā),第二步可以完全自動化:從樣本已經轉移到收件人的高真空蒸發(fā)器,直到程序結束,儀器充分控制真空,標本的位置相對于金屬/碳源和沉積材料的厚度。
編程序列
兩個電子***支使用在這個準備的過程中,這兩個需要脫氣,以避免相當退化的真空由于加熱在當下的實際蒸發(fā)開始。 而不是兩個后續(xù)德加/泵/蒸發(fā)周期Pt / C和C,它是首選先德加兩***,然后泵需要相當長的時間來達到一個好的過程真空蒸發(fā)材料。 一個自動序列正在這里描述實現(xiàn)該方法。 Pt / C***安裝在正確的端口,C***在左邊。
材料
材料使用Pt標準定義的“白金德加”設置,50 W脫氣的力量,和120秒脫氣。
材料使用C標準設置“碳德加”的定義,75 W脫氣的力量,和300秒脫氣。
兩種材料“鉑沒有德加”和“碳不德”具有相同的屬性定義為原始材料,但脫氣是停用。
流程
過程“脫氣Pt / C”旨在德加Pt / C***只是編程使用的材料“白金德加”。 這一過程將開始為1.0×10 4 mbar,蒸發(fā)低30 W的力量,和目標厚度為0.0 nm打開快門后立即終止。 設置階段地位因此過時了。
脫氣過程”C”旨在德加C***只是編程使用材料“碳德加”。 這一過程將開始為1.0×10 4 mbar,蒸發(fā)低30 W的力量,和目標厚度為0.0 nm打開快門后立即終止。 設置階段地位因此過時了。
過程“陰影Pt / C”程序使用以下設置:材料“鉑不德”,功率100 W目標,目標厚度2.0 nm,真空< 2.5×10 5 mbar、舞臺在-54°傾斜(對應于5°相對于***),最大工作距離,旋轉5(最大值)。
“支持度”是編程過程使用以下設置:材料“碳無德”,120 W targat力量,目標厚度6.0 nm,真空< 2.5×10 5 mbar,舞臺上20°傾斜(相對于水平),最大工作距離,旋轉5(最大值)。
序列
一個序列組成的“脫氣Pt / C”,“脫氣C”,“陰影Pt / C”,“支持度”準備。
準備
在實驗之前,Pt / C和C***清洗徹底,細絲的目標和建立根據手冊。 Pt / C***是安裝在真空室的正確的端口,C***在左邊。 佬司的儀器成立(低角度旋轉跟蹤)階段和石英晶體在側臥位。
130μg /毫升dsDNA長度1010完全(對應343海里)在噴灑稀釋1:20緩沖區(qū)(100中毒/ l醋酸銨,30%的甘油,pH值7.6)。 小水滴噴灑噴霧裝置中描述到新開辟的云母片表面大約2×2毫米大小和安裝與雙面膠帶在50毫米圓形濾紙。
噴灑后,對濾紙樣品立即轉移到隨時準備徠卡EM ACE600和疏散。 上面列出的順序與被處決,商會是在完成時自動排放。
濾紙上的副本被從真空室和轉移到潮濕的cham-ber,制成的塑料盤子,封口膜(使樣本變濕),和濕濾紙。 促進超然的復制品,他們孵化在烤箱45°C 30分鐘。
隨后,副本是浮在表面的蒸餾水在一個白盤子里,挑了一個un-filmed 400目銅網格,ddH轉移到另一個盤 2 O所有殘余有機物的去除(甘油),拿起另一個網格。 多余的水從側面涂抹和技巧的濾紙的鉗,樣本被風干。
空氣干燥的副本在透射電子顯微鏡下觀察到在80千伏,感興趣的區(qū)域可以通過晶體的殘留鹽形成的中心干水滴中描述。 圖像記錄用CCD相機的像素大小0.373 nm /像素。
圖1:如在透射電子顯微鏡中的文本描述和可視化制備的低角度旋轉遮蔽的DNA。單個分子是清楚可見的，并顯示出良好的對比度。使用斐濟，340納米的平均長度測量組（n =8）。 （下圖）在較高的放大倍數圖像允許評估對比增強金屬的粒度。桿（頂部，底部）= 100納米