流通（通常被稱為交叉或串?dāng)_）的熒光發(fā)射，由于很寬的帶寬和非對(duì)稱譜形的許多常見的熒光團(tuán)的表現(xiàn)，是一個(gè)根本的問題，必須解決兩個(gè)寬視場(chǎng)和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。這種現(xiàn)象通常表現(xiàn)為一個(gè)熒光團(tuán)在光電倍增管通道或通過濾波器組合保留第二熒光檢測(cè)的發(fā)射。流通通過工件通常的解釋復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是如果熒光團(tuán)的亞細(xì)胞共定位是調(diào)查或定量測(cè)量是必要的，如在共振能量轉(zhuǎn)移（煩惱的）和光漂白（FRAP）的案例。
成像的標(biāo)本有兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光標(biāo)簽（或植物組織切片表現(xiàn)出高度的自發(fā)熒光）常并發(fā)流通或交叉的熒光發(fā)射，除非這兩個(gè)熒光基團(tuán)的光譜分布是非常良好的分離。例如，當(dāng)雙標(biāo)記與傳統(tǒng)的綠色和紅色的探針，熒光素和羅丹明流通通過，只能通過使用濾波器組的優(yōu)化熒光減少（和/或光電倍增管檢測(cè)器狹縫寬度），但是不能完全消除。這種效果是由于這樣的事實(shí)，這些染料有很寬的吸收和發(fā)射光譜表現(xiàn)出相當(dāng)程度的重疊。因此，利用氬離子激光488納米的熒光激發(fā)光譜線會(huì)產(chǎn)生激發(fā)羅丹明，雖然在較小的程度。此外，熒光發(fā)射將被檢測(cè)的光電倍增管通道或域?yàn)V波器組保留羅丹明。
光譜泄放通過在小鼠小腸和Cy3標(biāo)記的Alexa Fluor 488個(gè)薄片（花青染料），和成像激光掃描共聚焦顯微鏡具有可調(diào)節(jié)的光電倍增管縫，如圖1所示。這些熒光表現(xiàn)出的吸收和發(fā)射光譜相似的熒光素和羅丹明，雖然略有不同的峰值波長(zhǎng)和稍微窄的帶寬。圖片說(shuō)明的數(shù)字1對(duì)（一）和1（b）得到了同時(shí)橫向掃描標(biāo)本采用氬離子激光（488納米；圖1（a））和一個(gè)綠色的氦氖激光（543納米；圖1（b））。注意的Alexa Fluor 488熒光滲漏明顯在Cy3檢測(cè)通道（圖1（b）），這表現(xiàn)在最終的融合圖像的重疊區(qū)域的黃色（圖1（c））。這件神器可以很容易地與熒光共定位的困惑。通過依次掃描標(biāo)本用單個(gè)激光器和熒光檢測(cè)每個(gè)通道與激光照明（圖1（d）和1（E）；在下面更詳細(xì)地討論），光譜泄放通過最小化（比較圖1（c）圖1（f））產(chǎn)生一個(gè)更準(zhǔn)確的合并圖像的熒光分布。
Alexa Fluor 488檢測(cè)通道（見圖1（a）和1（d））的光電倍增管的狹縫被設(shè)置為30納米的帶寬（從500到530納米），包括原發(fā)性探針的發(fā)射峰，但不捕獲的Cy3熒光發(fā)射大量。作為一個(gè)結(jié)果，的Alexa Fluor 488通道不在正常的電壓增益設(shè)置檢測(cè)Cy3熒光發(fā)射，無(wú)論是儀器掃描同時(shí)或順序。相反，從菁染料捕獲足夠的熒光發(fā)射，Cy3標(biāo)記檢測(cè)通道光電倍增管縫必須設(shè)置為一個(gè)更廣泛的范圍內(nèi)（555至625納米），這也允許的Alexa Fluor 488發(fā)射的波長(zhǎng)較長(zhǎng)，在檢測(cè)器寄存器。因此，調(diào)整檢測(cè)器狹縫（或干擾濾波器）不足以充分減少流通有高程度的重疊熒光光譜。在許多情況下，流通可以通過明智的選擇的熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射光譜具有很好的分離。用Alexa Fluor 568（Cy3在這個(gè)實(shí)例中的發(fā)光峰值波長(zhǎng)35納米的差異）會(huì)導(dǎo)致與氦氖激光激發(fā)效率稍低，但能顯著降低流通。
一個(gè)比較的光譜重疊的一系列的Alexa Fluor染料組合的雙色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可能有用，如圖2所示。所有的發(fā)射光譜進(jìn)行歸一化處理，比較，和重疊的區(qū)域是由灰色陰影表示。圖2（a），為綠色熒光的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555橙黃色熒光發(fā)射光譜表明峰值波長(zhǎng)分離清楚，也容易被人眼識(shí)別。然而，頻譜重疊的中等水平（灰色陰影區(qū)）表明，有相當(dāng)數(shù)量的排放的Alexa Fluor 488在Alexa Fluor 555的峰值發(fā)射波長(zhǎng)（由一個(gè)黑色的線運(yùn)行，從發(fā)射峰橫坐標(biāo)表示）。這種高水平的信號(hào)流通使探針的困難在哪兒的Alexa Fluor 488的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著高于Alexa Fluor 555的情況下分離，可由于一些因素，包括標(biāo)簽的目標(biāo)人群發(fā)生大的差異。這些探頭是由488納米和543納米的光譜線的氬離子和綠色的氦氖激光器有效激發(fā)，分別。
Alexa Fluor探針下降之間的光譜重疊的發(fā)射最大值的增加之間的帶寬，如圖2所示（B）。在這種情況下，的Alexa Fluor 488和橙色熒光的Alexa Fluor 594展示了一個(gè)減少重疊的水平相比，圖2（一）。兩種染料是很容易區(qū)分，對(duì)人的眼睛和光譜重疊程度低，應(yīng)以最小的好成績(jī)排在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，提供每個(gè)探針的濃度的樣品是相似的。Alexa Fluor 594是最有效的一個(gè)氪氬激光或黃色的氦氖激光器的594納米線的568納米線的興奮。或許在可見光發(fā)光的Alexa Fluor染料的最佳光譜分離的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 633描繪在圖2（c）的比較。幾乎沒有任何的光譜重疊之間的這些染料和流通通過工件應(yīng)該是不存在的，即使在含有過量的Alexa Fluor 488例。Alexa Fluor 633探針是由紅色的氦氖激光或氪氬激光647納米線的633納米的光譜線的有效激勵(lì)。
在描述的光譜重疊的工件，條款流通，交叉，和串?dāng)_經(jīng)?；Q。雖然流通和交叉引用的熒光發(fā)射的溢出（或興奮）從一個(gè)濾波器組或光電倍增管檢測(cè)通道到另一個(gè)，串?dāng)_是廣泛應(yīng)用于過濾行業(yè)描述最低衰減水平放置兩濾波器串聯(lián)在一起的。一個(gè)固定的濾波器組合的串?dāng)_值為制造商匹配時(shí)，熒光激發(fā)，發(fā)射是非常重要的，和一套雙色分光鏡的過濾器，但有點(diǎn)不同于光譜泄放通過共聚焦顯微鏡。因此，應(yīng)小心使用選擇項(xiàng)從一個(gè)檢測(cè)器通道到另一個(gè)描述的熒光發(fā)射的重疊，和研究者應(yīng)該認(rèn)識(shí)到不同的術(shù)語(yǔ)。
光譜交叉可以激發(fā)和合成的熒光和熒光蛋白質(zhì)通常利用共聚焦顯微鏡發(fā)射過程中發(fā)生的。在一般情況下，熒光吸收之間的交叉（或興奮）光譜譜線發(fā)生向藍(lán)端（短波長(zhǎng)）的頻譜，而熒光發(fā)射光譜之間的交叉發(fā)生在紅（長(zhǎng)波長(zhǎng)）區(qū)。例如，從一個(gè)綠色的熒光發(fā)射的紅光發(fā)射濾波器通?？梢酝ㄟ^檢測(cè)，但紅色染料是只有很少的成像通過綠色發(fā)射濾波器。這是由于這樣的事實(shí)，和發(fā)射光譜的染料不均勻的吸收，但通常顯示長(zhǎng)，傾斜的尾部，覆蓋地區(qū)的幾十到幾百納米的。吸收光譜一般都傾向于較短的波長(zhǎng)，而偏向于較長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光譜。為此，多色熒光成像應(yīng)與紅了（長(zhǎng)波長(zhǎng)峰值發(fā)射）染料成像第一，使用的激發(fā)波長(zhǎng)，只有最低限度的吸收光譜的藍(lán)染料的傾斜，尾巴。
樣品標(biāo)簽的預(yù)防措施，減少流通
確定的物理和空間位置，以及生物分子和感興趣的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)，標(biāo)記標(biāo)本與兩個(gè)或兩個(gè)以上的探針在熒光顯微鏡是一種非常有效的技術(shù)。在這方面，激光共聚焦顯微鏡（當(dāng)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的激光器）非常適合于多標(biāo)記技術(shù)由于區(qū)分個(gè)別熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光譜之間通過引導(dǎo)信號(hào)檢測(cè)能力的幾個(gè)途徑。有，然而，眾多的限制，必須在執(zhí)行多個(gè)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，無(wú)論是傳統(tǒng)的廣角熒光顯微鏡和激光共聚焦或。
常用的熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光譜有明顯不同的關(guān)于帶寬，峰值發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)稱性，和數(shù)量的最大值。在多標(biāo)記的標(biāo)本，如果標(biāo)簽和從熒光團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度不均衡度，明亮的信號(hào)可以壓倒和滲透屏障濾光通道保留較弱的熒光團(tuán)或那些不太豐富的物鏡。結(jié)果往往是從overstained熒光記錄保留一個(gè)低強(qiáng)度的探索頻道形象的重大貢獻(xiàn)。從探針如熒光素和羅丹明熒光強(qiáng)度（以及他們的親屬）應(yīng)該是相似的，根據(jù)試樣中的染料量和照明光源的調(diào)整。例如，在相同濃度下，羅丹明興奮比在廣角熒光眼底更有效（由一個(gè)因子10）由于在汞電弧光譜明亮的546納米的發(fā)射線。
熒光發(fā)射不小心被過分強(qiáng)調(diào)在試樣的制備。在成像過程中，表觀平衡可以通過改變?cè)鲆妫怆姳对龉茈妷赫{(diào)整，或在激光共聚焦顯微鏡或通過廣角熒光燈中電弧放電的中性密度過濾器使用單獨(dú)的檢測(cè)通道的激光功率。然而，簡(jiǎn)單的平衡與目標(biāo)數(shù)量的熒光量和顏色在試樣制備將減輕許多問題時(shí)，成像和，在一般情況下，導(dǎo)致較高的圖像。這個(gè)概念是在圖3中用熒光素和羅丹明雙標(biāo)簽的情況說(shuō)明（僅給出的熒光發(fā)射光譜）。每個(gè)檢測(cè)通道窗口列出了一個(gè)彩色的盒子在圖3中，用熒光通道采集信號(hào)490和555納米之間（紅色框）和羅丹明通道設(shè)置范圍為570到665毫微米（藍(lán)箱）。請(qǐng)注意，羅丹明信道具有顯著更廣泛的為了從傾斜的長(zhǎng)波長(zhǎng)的尾部區(qū)域的發(fā)射光譜采集信號(hào)帶寬。
如果熒光團(tuán)濃度是平衡的，這兩個(gè)熒光基團(tuán)產(chǎn)生類似的發(fā)射強(qiáng)度，再流通量從一個(gè)通道到另一個(gè)顯示為灰色區(qū)域重疊的標(biāo)記1和2圖3。顯然，一個(gè)顯著較高的熒光發(fā)射水平跨入羅丹明通道比反之亦然。程度的流通可以減少，在這種情況下，通過降低熒光素的濃度保持恒定，羅丹明。在這種情況下，熒光素標(biāo)記的水平大大超過了羅丹明，流通量及通過越來(lái)越嚴(yán)重的地區(qū)，由標(biāo)記重疊的增加說(shuō)明3和4（注意，熒光素的濃度增加一倍，三倍，分別）。在最高的熒光素濃度圖3所示，通過排放量（面積流通4）在羅丹明渠道收集了幾乎等于該目標(biāo)的熒光發(fā)射本身。
當(dāng)選擇多標(biāo)記樣品的熒光探針，最聰明和最耐光熒光基團(tuán)應(yīng)保留最豐富的靶細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，綠色和紅色的熒光染料往往要比那些在藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光的部分頻譜。然而，即使當(dāng)探針濃度對(duì)量子產(chǎn)率，光，照明源和目標(biāo)數(shù)量，嚴(yán)格控制，信號(hào)的電平交叉和流通通常是10和百分之15之間除非發(fā)射光譜最大值由100至150納米以上的分離。此外，局部環(huán)境的熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射光譜分布有顯著的影響，所以光譜的熒光基團(tuán)在溶液中分離的廠商發(fā)表會(huì)顯著不同于實(shí)際的實(shí)驗(yàn)條件下觀察到的。在涉及兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光實(shí)驗(yàn)，應(yīng)始終使用過濾器設(shè)置保證水平的流通通過其他熒光染色標(biāo)本的檢查單是最小的控制。在許多情況下，主要的原因是不流通通過染色的熒光基團(tuán)，可通過改變?nèi)旧珔f(xié)議而不是調(diào)整曝光時(shí)間在顯微鏡下或在收購(gòu)后處理圖像的校正進(jìn)行廣泛的康復(fù)。
對(duì)熒光團(tuán)的發(fā)射分離的儀器方法
傳統(tǒng)的熒光素和羅丹明熒光團(tuán)，連同他們的Alexa Fluor和菁染料的親戚，是在廣角和共聚焦熒光顯微鏡的雙標(biāo)記流行組合。事實(shí)上，熒光素和羅丹明探針已廣泛使用，大多數(shù)顯微鏡和售后過濾器的廠家有專門的過濾集命名后，他們的反應(yīng)異硫氰酸酯中間體（異硫氰酸熒光素和TRITC，分別）。寬視場(chǎng)顯微鏡配備了電弧放電激發(fā)這些熒光燈一般使用495和546納米的光譜峰從汞的燃燒器，而現(xiàn)代的共聚焦顯微鏡采用氬離子激光488納米的光譜線和綠色的氦氖激光器的543納米線。
熒光素和羅丹明的熒光基團(tuán)結(jié)合，然而，往往產(chǎn)生小于激光共聚焦顯微鏡，只配備一個(gè)氬或氪氬激光優(yōu)化結(jié)果，既不發(fā)射波長(zhǎng)適當(dāng)?shù)淖V線（在530和560納米）對(duì)羅丹明類熒光團(tuán)的最有效的激勵(lì)。相反，吸收峰在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)的熒光團(tuán)居住，如Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 594，或德克薩斯紅（578，590，和596納米的吸收峰，分別）應(yīng)采用氪氬激光。在某些情況下，配備了多線氬離子激光顯微鏡是用來(lái)激發(fā)熒光和與488和514納米線的羅丹明衍生物。然而，只有熒光素及其衍生物在488納米的有效激發(fā)，最具有高度傾斜發(fā)射的尾巴，表現(xiàn)出明顯的重疊與羅丹明類探針的發(fā)射光譜。此外，在514納米，熒光素和羅丹明（及其家屬）幾乎是同樣的興奮，導(dǎo)致大量的頻譜流通。
選擇兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光基團(tuán)的單波長(zhǎng)激光同時(shí)激發(fā)嚴(yán)重限制了實(shí)驗(yàn)參數(shù)。熒光光譜必須允許同時(shí)激發(fā)顯著重疊，但大多數(shù)組合，一個(gè)熒光會(huì)被激發(fā)到一個(gè)更高的程度上比其他人。此外，發(fā)射光譜應(yīng)該從每個(gè)熒光團(tuán)是精心選擇的帶通濾波器，有效地分離的信號(hào)的最小為重疊度。此外，在最短的熒光激發(fā)波長(zhǎng)的發(fā)射光譜不重疊的熒光團(tuán)的吸收光譜來(lái)避免能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。由于這些嚴(yán)格的要求，以及合適的熒光普遍缺乏，多數(shù)研究者選擇兩個(gè)或兩個(gè)以上的激光共聚焦顯微鏡多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
兩個(gè)寬視場(chǎng)和激光共聚焦顯微鏡使用了鍍膜玻璃或多個(gè)薄膜干涉層熒光發(fā)射信號(hào)分離過濾器。在這些儀器中，一個(gè)雙色分光鏡把光分成兩個(gè)途徑，一個(gè)反映到樣品和其他傳送到探測(cè)器。一個(gè)帶通屏障或發(fā)射濾波器由分束器發(fā)送提煉之前由探測(cè)器收集的光，一個(gè)電荷耦合器件（CCD）或光電倍增管。雙色鏡和屏障過濾器執(zhí)行的功能的限制的激發(fā)光到達(dá)檢測(cè)器和從一個(gè)單一的熒光收集最多發(fā)射信號(hào)不允許從其他的熒光排放污染的信號(hào)。因此，熒光發(fā)射的分離是高度依賴于濾波器的特性。良好的間距和/或過寬的發(fā)射光譜譜線，可以利用寬通帶發(fā)射濾波器覆蓋一百納米或更大，并產(chǎn)生明亮的圖像，由于熒光信號(hào)通過濾波器的高水平。這些高信號(hào)電平可以通過中性密度過濾器在廣角熒光共聚焦顯微鏡或通過降低激光功率控制。相反，緊密重疊發(fā)射光譜需要最佳的分離很窄的帶通濾波器，但在較低的信號(hào)電平的成本。
使用濾波器組檢測(cè)的熒光發(fā)射是通過過濾收集所有的光子都以同樣的方式處理的主要缺點(diǎn)，無(wú)論源。通過一個(gè)典型的濾波器組的傳輸不必要的波長(zhǎng)一般在光子穿過總數(shù)的百分之10。為了解決這個(gè)難題，共焦制造商正在開發(fā)多光譜這是能夠區(qū)分基于單個(gè)熒光光譜，熒光發(fā)射源儀器（一種技術(shù)，通常稱為發(fā)射指紋）。這些先進(jìn)的儀器的設(shè)計(jì)，這將可能成為現(xiàn)代共焦顯微鏡的中心，利用一個(gè)或更多的幾種可供選擇的區(qū)分排放在實(shí)驗(yàn)中，它是不可能的或可行的選擇，非重疊的熒光探針。在多光譜成像的最簡(jiǎn)單的方法是解剖的熒光發(fā)射波長(zhǎng)為用細(xì)內(nèi)襯色散光柵和極限集使用可移動(dòng)的狹縫的特定區(qū)域。第二種方法使用一個(gè)棱鏡和聲光偏轉(zhuǎn)器代替色散光柵具有相同的功能，而三分之一的夫婦的色散光柵設(shè)計(jì)的多通道光電倍增管收集一系列窄波段（10納米）。多光譜顯微結(jié)構(gòu)各有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，但所有三個(gè)能夠波長(zhǎng)歧視的分辨率只有幾納米。
多光譜激光共聚焦顯微鏡的方法是選擇當(dāng)成像的多個(gè)熒光蛋白變體在一個(gè)單一的實(shí)驗(yàn)或自然發(fā)生的和固定的誘導(dǎo)熒光（通常統(tǒng)稱為自體熒光物鏡的熒光信號(hào)）的面具。不必要的發(fā)射信號(hào)的自體熒光和其他形式往往跨越多個(gè)頻道，一個(gè)復(fù)雜的定量分析的因素。此外，當(dāng)四個(gè)或更多的熒光基團(tuán)被使用在一個(gè)單一的實(shí)驗(yàn)，光譜重疊的一個(gè)顯著的程度，并導(dǎo)致流通通過工件，是不可避免的。在這種情況下，多光譜成像是消除流通的最有前途的技術(shù)之一。多光譜成像的缺點(diǎn)之一是減少信號(hào)伴隨通常需要的熒光發(fā)射分離狹窄的檢測(cè)窗口。消除流通的新興工具的方法（稱為熒光壽命成像顯微鏡，或攝影）是基于門控熒光壽命研究的輸出相似的光譜譜線，熒光可以區(qū)分由于各自的衰減特性。
雖然多光譜成像是一種很有前途的處理光譜泄放通過新的方法，所需的儀器是目前非常昂貴。激光共聚焦顯微鏡配備聲光可調(diào)諧濾波器（的案例）或類似的快速激光線開關(guān)裝置可以有效地利用順序掃描標(biāo)本，使用一種稱為高速頻道切換或技術(shù)multitracking。這種方法使單個(gè)熒光基團(tuán)以減少或消除流通通過發(fā)射順序激發(fā)和收集，但并不能解決問題時(shí)，吸收和發(fā)射光譜重疊廣泛。在實(shí)踐中，激光線的快速切換，無(wú)論是單獨(dú)或整個(gè)框架，連接到每個(gè)通道作為其目標(biāo)的熒光激發(fā)序列檢測(cè)（見圖4）。例如圖4所示，用Alexa Fluor 488和Cy3，488納米的氬離子激光線采用激發(fā)Alexa Fluor 488是打開激光掃描在年線X方向的同時(shí)，收集的Alexa Fluor 488發(fā)射使用設(shè)置為適當(dāng)?shù)臑V波器的信道檢測(cè)器。在返回路徑，488納米線的關(guān)閉和樣品中的Cy3熒光探針與543納米氦氖激光線激發(fā)，又只收集熒光發(fā)射使用的Cy3兼容濾波器組的第二信道檢測(cè)器。這避免激發(fā)熒光掃描序列都同時(shí)是一個(gè)可控制流通最有效的方法，尤其是當(dāng)發(fā)射濾波器的選擇是有限的。
順序掃描幀的每個(gè)通道熒光信號(hào)的并行采集是一個(gè)產(chǎn)生固定的標(biāo)本，固定化很好的圖像很好的方法。然而，當(dāng)采集圖像已被標(biāo)記有兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光活細(xì)胞，甚至一個(gè)小的運(yùn)動(dòng)程度的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)妥協(xié)的圖像和減少共定位精度的研究。因此，對(duì)活細(xì)胞的調(diào)查更謹(jǐn)慎的使用快速多軌線掃描快速單個(gè)激光線之間的開關(guān)，每個(gè)信道在一個(gè)時(shí)間框架是被記錄在案的線圖像信息采集。激光共聚焦顯微鏡配備了AOTF激光控制器可交替線速度媲美或超過時(shí)所獲得的掃描兩個(gè)或三個(gè)通道同時(shí)對(duì)舊儀器掃描圖像采集。
通過熒光蛋白在流通
熒光蛋白，其發(fā)射波長(zhǎng)從藍(lán)色到紅色現(xiàn)在廣泛使用，是非常有效的用于活細(xì)胞成像研究使用激光共聚焦顯微鏡，盡管有一些權(quán)衡。例如，數(shù)據(jù)采集的速度降低時(shí)，兩種以上受雇在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)熒光蛋白通常需要完全不同的圖像采集條件。解決頻譜流通往往是更復(fù)雜的比傳統(tǒng)熒光蛋白合成探針，特別是因?yàn)榍罢叩陌l(fā)射光譜往往是相當(dāng)廣泛的。此外，由于不同的熒光蛋白的相對(duì)亮度的變化，每一種顏色都可能需要不同的信號(hào)積分時(shí)間。增強(qiáng)型青色和藍(lán)色的品種（生物和環(huán)抱式接骨板）很暗淡相比，綠色和黃色熒光蛋白，需要更長(zhǎng)的采集時(shí)間，飽和明亮的熒光團(tuán)。因此，當(dāng)使用熒光蛋白，實(shí)驗(yàn)要求必須與熒光的選擇來(lái)確定，以及分離的光譜特征是相似的發(fā)射強(qiáng)度的組合。
一個(gè)優(yōu)雅的例子，通過使用熒光共焦成像的流通與高度重疊的光譜管理是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（同時(shí)檢測(cè)EGFP）和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）在活細(xì)胞。在這種情況下，黃色熒光蛋白的圖像的收集應(yīng)首先使用的氬離子激光514納米的光譜線，其中只有輕微的激發(fā)的綠色熒光蛋白（見圖5）。最佳的檢測(cè)，光電倍增管檢測(cè)器縫應(yīng)該設(shè)置一個(gè)延伸的窄帶寬的地區(qū)只有20納米（530納米到550納米；圖5（b））或類似的帶通濾波器可以采用屏障。然而，該發(fā)射濾波器帶寬的精確的大小并不重要，因?yàn)橹挥悬S色熒光蛋白是興奮。
在第二順序掃描，氬離子激光器的477納米線是用于圖像的綠色熒光蛋白在一個(gè)很窄的帶通（10納米490-500毫微米；圖5）發(fā)射濾波器的帶寬或縫。由于發(fā)射收集此實(shí)例中的關(guān)鍵，它是更容易執(zhí)行成像序列，利用狹縫排除EYFP流通通過信號(hào)強(qiáng)度的費(fèi)用。請(qǐng)注意，雖然488納米氬離子激光譜線更接近的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白激發(fā)最大，它太靠近發(fā)射濾波器（或狹縫）帶通區(qū)域以排除激光反射光會(huì)使圖像采集。
目前，最明亮的熒光蛋白綠色和黃色，但這些物種之間的歧視，往往是成功的事實(shí)，它們的光譜峰的只有25納米分離的阻礙。正如上面所討論的，雙重或多色實(shí)驗(yàn)用綠色和黃色熒光的組合是可能的，但流通之間通過濾波器組和/或從根本上減少帶寬檢測(cè)狹縫的必要性，提出了一個(gè)重大的問題。更常見的是，黃色熒光蛋白耦合雙色成像實(shí)驗(yàn)的青色熒光蛋白。雖然青色熒光蛋白不比藍(lán)色的物種更明亮，它已經(jīng)能夠與458納米的氬離子激光線常用的共聚焦顯微鏡上激發(fā)的兩大優(yōu)勢(shì)，而且更耐漂白比藍(lán)色熒光蛋白。
組合的紅色熒光蛋白綠色或黃色熒光蛋白也能產(chǎn)生足夠的光譜分離，但生物制品，如緩慢的成熟和團(tuán)聚體的形成，往往復(fù)雜的研究與紅色熒光蛋白的種類。第二代紅色熒光蛋白質(zhì)應(yīng)解決生物問題產(chǎn)生的多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的優(yōu)秀的候選人。新熒光蛋白質(zhì)的排放概況延伸到遠(yuǎn)紅光和近紅外的地平線上。這些熒光團(tuán)應(yīng)該能夠利用紅氦氖633納米的光譜線，目前在很多高端的共焦系統(tǒng)。
量子點(diǎn)
量子點(diǎn)，這是涂有親水性聚合物殼半導(dǎo)體納米晶和共軛的抗體或其它生物活性基團(tuán)，有沒有最傳統(tǒng)的熒光團(tuán)的共享。不同于典型的有機(jī)熒光染料或熒光蛋白，它顯示了高度定義的頻譜分布，量子點(diǎn)的吸收光譜，增加穩(wěn)步減少波長(zhǎng)。相反，熒光發(fā)射強(qiáng)度限制在一個(gè)最大波長(zhǎng)依賴于點(diǎn)的大小對(duì)稱峰，但獨(dú)立的激發(fā)波長(zhǎng)。作為一個(gè)結(jié)果，相同的發(fā)射中觀察到無(wú)論量子點(diǎn)是在300，400，500或600納米，興奮，但熒光強(qiáng)度急劇增加，在較短的激發(fā)波長(zhǎng)。例如，一個(gè)典型的量子點(diǎn)的共軛，發(fā)出橙色區(qū)域的消光系數(shù)（605納米）是約5倍時(shí)，半導(dǎo)體是在400和600納米的激發(fā)。在一個(gè)典型的量子點(diǎn)的共軛大約是30納米半最大值寬度，和光譜剖面不朝較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（具有較高的強(qiáng)度，扭曲的“尾巴”），與大多數(shù)有機(jī)熒光染料的情況就是這樣。窄的發(fā)射譜使幾個(gè)量子點(diǎn)偶聯(lián)物是一個(gè)最低水平的同時(shí)通過觀察流通。
在激光共聚焦顯微鏡，量子點(diǎn)激發(fā)不同程度的效率最多的普通激光系統(tǒng)產(chǎn)生的光譜線，包括氬，氦鎘，氪氬，氦氖和綠色。特別有效的令人興奮的量子點(diǎn)中的紫色和紫外區(qū)域的新的藍(lán)光二極管和二極管泵浦固體激光器，具有突出的譜線在442納米及以下。405納米的藍(lán)色激光二極管是一種經(jīng)濟(jì)的激勵(lì)源，使用量子點(diǎn)由于其高的消光系數(shù)在這個(gè)波長(zhǎng)是非常有效的。在激光共聚焦顯微鏡使用這些熒光團(tuán)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是刺激多個(gè)量子點(diǎn)大小的能力（和光譜的顏色）在同一試樣與一個(gè)單一的激發(fā)波長(zhǎng)，使這些探針的多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的優(yōu)秀的候選人。量子點(diǎn)是目前的發(fā)射最大值從525到705納米的20至40納米的增量擴(kuò)展，和一個(gè)近紅外探頭的發(fā)射峰在800納米。通過仔細(xì)選擇合適的量子點(diǎn)的組合（例如，525，585，和655；見圖6），共聚焦實(shí)驗(yàn)可以與一個(gè)單一的激光和顯著減少流通的工件時(shí)，相比傳統(tǒng)的熒光團(tuán)進(jìn)行了。
通過校正流通
由于數(shù)量的熒光信號(hào)在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可以輕易地超過了檢測(cè)系統(tǒng)的分辨能力，無(wú)論儀器的復(fù)雜程度，收購(gòu)后的圖像處理是經(jīng)常流通通過校正的唯一選擇。一系列的控制樣品應(yīng)準(zhǔn)備在進(jìn)行多個(gè)標(biāo)記為兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光減少因流通通過工件實(shí)驗(yàn)結(jié)果的混亂。最重要的是控制無(wú)二次抗體或合成的熒光團(tuán)（的標(biāo)本制備背景控制）和標(biāo)簽的標(biāo)本分別（每個(gè)熒光團(tuán)的流通控制）。后臺(tái)控制應(yīng)獨(dú)立地研究每個(gè)激光和檢測(cè)通道的信號(hào)增益和偏移，應(yīng)采用最終成像序列的極限。所有的通道將被用于圖像的多標(biāo)記試樣必須經(jīng)過一個(gè)獨(dú)立的背景校正，因?yàn)槊總€(gè)通道的熒光水平也有很大的差別。一般來(lái)說(shuō)，熒光比較短的激發(fā)波長(zhǎng)，如那些所發(fā)出的紫外線，405納米和488納米二極管，氬離子激光器。綠色，黃色，橙色和紅色激光通道，是不容易受到熒光工件。
流通的控制是必要的確定信號(hào)增益量可能在每個(gè)通道沒有引發(fā)流通到相鄰信道。例如，當(dāng)檢查雙標(biāo)記的熒光素和羅丹明標(biāo)本，標(biāo)本含有熒光素和羅丹明就應(yīng)該準(zhǔn)備。建立水平控制流通，熒光成像與氬離子激光488納米的最佳條件下，信號(hào)在羅丹明通道記錄的數(shù)量（注有標(biāo)本中沒有羅丹明染料）。這個(gè)信號(hào)是通過結(jié)合背景熒光眼底流通。重復(fù)這一過程與羅丹明的控制，這一次激動(dòng)人心的氦氖543納米線和檢查排到熒光通道。
這種方法通過校正需要流通的熒光強(qiáng)度和熒光團(tuán)濃度之間的關(guān)系是不變的圖像中的所有像素。光電倍增管用于激光共聚焦顯微鏡表現(xiàn)出良好的線性成像時(shí)，在一個(gè)單一的波長(zhǎng)，但在所觀察到的信號(hào)電平的大的變化可以與單個(gè)頻道由于光電倍增管的量子效率、波長(zhǎng)的探測(cè)光之間的高度非線性關(guān)系（尤其是在響應(yīng)曲線的極端）。此外，局部環(huán)境變量和光漂白在區(qū)域研究的影響必須考慮。在熒光發(fā)射光譜的波長(zhǎng)分布的變化，雖然不太可能與最流行的探針，將影響獲得的熒光信號(hào)的檢測(cè)器之間的相對(duì)分布。
一旦有合適的控制已準(zhǔn)備和分析，它是可能的估計(jì)信號(hào)量的流通是可能發(fā)生在試樣的熒光團(tuán)對(duì)目標(biāo)成像。正如上面所討論的，甚至與濾波器帶寬的優(yōu)化，熒光發(fā)射的一部分將滲入羅丹明通道和一些羅丹明排放會(huì)滲入熒光素通道，雖然羅丹明流通會(huì)比觀察熒光素少得多。一些商業(yè)軟件包可以處理流通通過數(shù)據(jù)使用線性分解算法，和共聚焦顯微鏡制造商經(jīng)常束類似的軟件和工具。該軟件可以應(yīng)用線性聯(lián)立方程校正算法對(duì)圖像中的每個(gè)像素確定流通量的基礎(chǔ)上通過與試樣的強(qiáng)度比和控制記錄。
光譜泄放通過工件很容易混淆的共振能量轉(zhuǎn)移，共定位，和非特異性背景染色。如果一個(gè)熒光發(fā)射光譜重疊顯著的第二探針的吸收光譜，然后地區(qū)兩個(gè)熒光共定位可能發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移。流通可以區(qū)分進(jìn)行控制測(cè)量共振能量轉(zhuǎn)移，如上所述，標(biāo)本與個(gè)別熒光標(biāo)記單。共振能量轉(zhuǎn)移（后可觀察到流通通過校正）的興奮與最低的最大吸收波長(zhǎng)的熒光，然后檢測(cè)的熒光團(tuán)的發(fā)射光譜與激發(fā)探測(cè)通道的信號(hào)。使用熒光素和羅丹明例，激動(dòng)人心的熒光素與488納米激光后，熒光的羅丹明通道監(jiān)測(cè)。任何信號(hào)記錄在羅丹明通道可能是由于共振能量轉(zhuǎn)移，但只有在地區(qū)的兩個(gè)探針共定位。
結(jié)論
總之，最好的熒光共聚焦或廣角熒光顯微鏡有最大吸收，密切配合激光和電弧放電譜線利用激發(fā)探針。選擇最豐富的目標(biāo)最高的量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)將幫助平衡整體熒光發(fā)射。此外，窄的發(fā)射光譜探針可以大大降低問題的流通，但不會(huì)完全消除。光學(xué)濾波器組選擇研究熒光發(fā)射應(yīng)緊密匹配的探針光譜對(duì)帶寬的大小和位置。同時(shí)，干擾過濾器阻塞水平往往隨制造商的不同而不同，應(yīng)檢查以確保不必要的熒光發(fā)射是由過濾器排除集用于成像。
許多新合成的熒光團(tuán)表現(xiàn)出顯著減少光漂白的敏感性，它允許較長(zhǎng)的積分時(shí)間與CCD相機(jī)或光子采集時(shí)間降低激光功率在激光共聚焦顯微鏡。這個(gè)結(jié)果在更高質(zhì)量的圖像和更少的細(xì)胞損傷過程中的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。新熒光蛋白質(zhì)是比以前的版本更穩(wěn)定，更可能不破壞細(xì)胞的代謝過程比合成的探針。然而，應(yīng)該指出的是，所有的熒光基團(tuán)會(huì)影響細(xì)胞的行為在一定程度上的潛力，特別是如果探針的化學(xué)和物理特性是由環(huán)境變量的顯著改變，如離子濃度，pH值，和疏水性的。
無(wú)論是熒光的物理特性，目標(biāo)高度的特異性，以獲得合適的信號(hào)水平和減少流通通過工件是必要的，尤其是在二級(jí)抗體的免疫制劑。即使是少量的非特異性標(biāo)記將產(chǎn)生一個(gè)高度的背景，既降低了試樣的圖像和混淆的定量解釋。許多設(shè)計(jì)突出的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的探針（如高爾基體和線粒體）具有特異性相對(duì)較低的水平，但仍然有用，因?yàn)橐阎膸缀涡螤畹倪@些細(xì)胞器。
作為制造商開發(fā)更先進(jìn)的熒光團(tuán)和更便宜的二極管激光系統(tǒng)的光譜線在可見光和近紅外區(qū)域，選擇了多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的聚焦和廣角熒光顯微鏡通過工件流通不會(huì)變得更加容易。例如，激光共聚焦顯微鏡配備了一個(gè)405納米的半導(dǎo)體激光，543納米的氦氖激光，和一個(gè)650納米的紅色激光二極管可以激發(fā)發(fā)射光譜的波長(zhǎng)的最大值在100納米的熒光基團(tuán)分離，從而最大限度地減少了潛在的流通。此外，在遠(yuǎn)紅光和紅外發(fā)射光譜的熒光蛋白，將需要新激光譜線，不損害細(xì)胞的代謝過程，比目前的紫色，藍(lán)色，綠色系統(tǒng)。
