尼康顯微鏡：多色共聚焦顯微鏡的光學(xué)像差和物鏡選擇
優(yōu)化的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化了激光共聚焦顯微鏡的程度上，它已經(jīng)成為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生物學(xué)研究工具。然而，激光共聚焦顯微鏡變得更加強(qiáng)大，他們也變得更加苛刻的光學(xué)元件的。事實(shí)上，導(dǎo)致圖像質(zhì)量的細(xì)微瑕疵廣角鏡的光學(xué)像差可以產(chǎn)生毀滅性的影響，在激光共聚焦顯微鏡。不幸的是，通常是隱藏的嚴(yán)格的光學(xué)要求，激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，保證了一個(gè)清晰的圖像，即使在顯微鏡是表現(xiàn)不佳。光學(xué)制造商提供了廣泛的顯微鏡物鏡，分別為特定應(yīng)用設(shè)計(jì)的。本報(bào)告演示了如何權(quán)衡參與物鏡設(shè)計(jì)可以影響共聚焦顯微鏡。
在過去的十年里，共聚焦顯微鏡已開發(fā)的技術(shù)僅限于專家在顯微鏡成標(biāo)準(zhǔn)的研究工具。它的增殖應(yīng)用盡可能多的從激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的快速發(fā)展，從成熟的商業(yè)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的用戶界面。最新的系統(tǒng)是近交鑰匙系統(tǒng)，即使是新手顯微鏡能迅速收集高質(zhì)量的圖像。具有諷刺意味的是，同樣的技術(shù)發(fā)展也刺激了共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)生物學(xué)中蔓延推理解共聚焦顯微鏡的光學(xué)性能比以往任何時(shí)候都更重要的方式，使光學(xué)共聚焦顯微鏡的極限。
共聚焦顯微鏡的最常見的應(yīng)用是比較分派或多個(gè)探頭在同一個(gè)細(xì)胞的行為。這樣的研究已經(jīng)成為可能，能夠有效地收集多種顏色的熒光，并開發(fā)新染料，延長(zhǎng)有用的光譜，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的發(fā)展。根據(jù)顯微鏡的配置的不同，可能需要這樣的研究，使用的光的波長(zhǎng)范圍從紫外到紅外的光學(xué)元件。要求準(zhǔn)確的彩色成像中得到了進(jìn)一步的發(fā)展比色法定量顯微鏡，如熒光比率測(cè)量離子濃度增加。
避免色差的光學(xué)設(shè)計(jì)的方程，這也考慮單色像差和參數(shù)，如光子效率高，視野大小，視野平直度，工作距離，和深入含水生物組織的圖像的能力只是其中的一部分。由于光學(xué)顯微鏡的設(shè)計(jì)體現(xiàn)了妥協(xié)這些不同的參數(shù)，制造商通常會(huì)設(shè)計(jì)出各種不同的顯微鏡物鏡，與各代表一組特定的設(shè)計(jì)權(quán)衡和各適合特定的應(yīng)用程序。這里討論的研究表明，顯微鏡物鏡的選擇可以產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。他們強(qiáng)調(diào)顯微鏡仔細(xì)選擇的物鏡是適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)應(yīng)用的重要性。
一個(gè)理想的鏡頭將所有顏色的光集中到同一個(gè)點(diǎn)。在現(xiàn)實(shí)中，所有的鏡頭有色差，不同顏色的光都集中到不同的點(diǎn)物業(yè)。通過顯微鏡目鏡觀察樣品時(shí)，這種缺陷使物體看起來(lái)有顏色的邊緣。當(dāng)成像彩色共焦顯微鏡中的樣品，這種缺陷在顏色不同的激勵(lì)照明被聚焦到樣品中的不同點(diǎn)，并收集從樣品中的不同點(diǎn)的不同顏色的發(fā)射。在圖像平面的水平方向發(fā)生位移，稱為橫向色差，因此在不同的放大倍率不同的顏色。此問題可以被最小化，通過限制分析顯微鏡視場(chǎng)的中心。然而，垂直色位移沿焦軸，簡(jiǎn)稱為軸向色差，整個(gè)顯微鏡視場(chǎng)。這顯然是一個(gè)問題，任何研究人員嘗試使用彩色激光共聚焦顯微鏡確定的相對(duì)分布多個(gè)探頭。3示出了圖1中的圖像，通過彩色共焦成像的結(jié)果如何關(guān)鍵取決于顯微鏡物鏡的性質(zhì)。
數(shù)字提供了比較平場(chǎng)氟40倍的物鏡，這是專為最高紫外線光傳輸性能，與100x物鏡，平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡設(shè)計(jì)最大程度減少色差。比較的一個(gè)方面，從玻璃蓋玻片面的反射圖像的垂直系列收集，可以使用488或647納米的光。由于是由一個(gè)單一的表面反射不同顏色的光，無(wú)色差的透鏡聚焦不同的顏色相同的焦平面。當(dāng)重放的作為垂直的橫截面，一個(gè)理想的透鏡收集的圖像將顯示單個(gè)水平行中，這兩種顏色完全重疊。在圖1的上半部分（一）說(shuō)明XZ截面的玻璃反射，與震源（z）的軸垂直方向，并展示該平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡100x物鏡接近這個(gè)理想的工作做一個(gè)可信的，解決的圖像兩種顏色的光在彼此的0.1微米的深度內(nèi)。相比之下，微創(chuàng)矯正40X平場(chǎng)氟物鏡檢測(cè)647納米的光，約1.2微米以上的488納米光的反射。玻璃反射的圖像，647納米光顯示為紅色，和488納米的光，以藍(lán)色顯示。比例尺表示的距離為1微米。
垂直差異的影響，這是明顯的熒光。此面板的下半部分（圖1（a））示出了垂直的橫截面有三個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記的有孔玻璃珠的圖像卷。使用100倍的俯視復(fù)消色差透鏡物鏡成像時(shí)，三個(gè)顏色重合，從而在一個(gè)白，合理圓形的圖像。與此相反，40倍物鏡產(chǎn)生一個(gè)明顯的垂直位移的紅色（600納米）或綠色（520納米）的熒光圖像，其中的遠(yuǎn)紅光熒光（680納米的排放量，以藍(lán)色表示）。此外，輕微的水平位移的遠(yuǎn)紅光的熒光反映橫向色差。
本發(fā)明提供一種生物的試驗(yàn)片，優(yōu)勢(shì)的事實(shí)，即胞內(nèi)體孵育細(xì)胞與熒光標(biāo)記的內(nèi)吞作用的配體可以被標(biāo)記。在每個(gè)核內(nèi)體中的大量的分子，可確保每個(gè)將包含相同的比率熒光探針。因此，內(nèi)涵體生物樣品中的顏色，將每個(gè)熒光反映相對(duì)熒光的貢獻(xiàn)，因?yàn)樗麄兡壳按谓馕龆葘?duì)象提供了一個(gè)極好的彩色激光共聚焦成像測(cè)試。圖1（b）示出了彩色圖像的細(xì)胞，核內(nèi)體中，已標(biāo)記的兩個(gè)fluoresceintransferrin（F-Tf的，發(fā)出綠色熒光）和Cy5-轉(zhuǎn)鐵蛋白（Cy5的-Tf的遠(yuǎn)紅熒光），使用100倍的收集平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡物鏡。兩個(gè)探頭的共定位個(gè)人在不斷的橙黃色的顏色是明顯的內(nèi)涵體和更加明顯的F-Tf的（圖1（c））和Cy5-Tf的高倍率圖像的比較（圖1 （d）條）。在這些圖像中（圖1（b）至圖1（d）段），比例尺表示的長(zhǎng)度為10微米。
然而，當(dāng)切換到40倍的平場(chǎng)氟物鏡時(shí)，在焦平面上的細(xì)微的差別是顯而易見的，即使之間的紅色和綠色的熒光標(biāo)記的TF結(jié)合的熒光素和若丹明（圖圖2（a））的細(xì)胞中，如圖。焦平面之間的紅色和綠色的熒光令人吃驚的差異導(dǎo)致的F-Tf的和Cy5-Tf的，現(xiàn)在似乎是完全不同的（圖2（b））的表觀分布的差異。
對(duì)于誰(shuí)是評(píng)估各種探頭的相對(duì)分布的細(xì)胞生物學(xué)家，這些位移會(huì)帶來(lái)災(zāi)難性的后果。焦平面上的差異，可以規(guī)避和總結(jié)整個(gè)垂直一系列的圖像卷成一個(gè)單一的投影，這消除這兩種顏色的焦平面上（圖2（c））的效果差異。在投影演示的每一個(gè)內(nèi)體顏色一致的黃色在每個(gè)內(nèi)體的兩個(gè)探頭的恒定比例。然而，由于此過程中丟棄所有垂直的信息，這是很少以適當(dāng)?shù)姆绞匠尸F(xiàn)共聚焦圖像。軸向色差的影響，也可以最小化，通過測(cè)量不同顏色的軸向偏移，并適合于每種顏色的焦平面從收集到的圖像相結(jié)合。此過程的一個(gè)例子，圖2（d）中所示，其中顯示了綠色和遠(yuǎn)紅光合并圖像采集間隔1.2微米與40倍的平場(chǎng)氟物鏡。在圖2的圖像的比例尺表示10微米的長(zhǎng)度。實(shí)現(xiàn)通過組合從不同的焦平面的圖像的校正是明顯的，當(dāng)比較各個(gè)探測(cè)器的圖像，如圖3所示。而圖3（a）和圖3（b）表示在采集圖像的在相同的焦平面，比較圖3（b）和圖3的F-Tf和Cy5的-Tf的分布之間的一致性差，（c）表示遠(yuǎn)紅光的圖像可以被收集1.2微米更深的綠色熒光圖像疊加。（圖3（a）至圖3（c）），在這些圖像中的比例尺對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)度為5微米。
雖然在不同顏色的光被聚焦在圖像體積的不同點(diǎn)色差的結(jié)果，球面象差可以深刻地降低共聚焦顯微鏡中的信號(hào)。球差透鏡軸向和周邊的光線集中到不同的點(diǎn)，從而造成圖像模糊的點(diǎn)光源。在共焦針孔相同的方式，有效地提高圖像的對(duì)比度通過拒絕焦點(diǎn)外的光，它有效地消除了大部分的熒光成像的球面像差的對(duì)象。
對(duì)于許多樣品，球面像差的主要來(lái)源，源于浸沒介質(zhì)和安裝介質(zhì)的折射率之間的差異。直到最近，最高分辨率，最佳矯正顯微鏡物鏡被設(shè)計(jì)為使用以石油為浸液。對(duì)于這些物鏡，球面像差被最小化時(shí)，整個(gè)光路有浸油的折射率（這是與玻璃相同），并隨距離累積到具有不同折射率的介質(zhì)。由于大多數(shù)樣品 - 特別是生物樣品 - 被安裝在明顯低于浸油的折射率的介質(zhì)，因此，球面像差限制使用油浸物鏡的圖象的卷的深度。
圖4顯示了在共聚焦顯微鏡，100倍的油浸平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡的物鏡是用來(lái)收集與F-Tf的標(biāo)記的細(xì)胞的圖像和安裝，數(shù)值為0微米的深度處（在蓋玻片的表面）中的球面像差的影響（圖4（a）條）（35微米）到水性介質(zhì)中（圖4（b）條）。在這兩種情況下，核內(nèi)體出現(xiàn)急劇定義，但累計(jì)深刻地影響到水性介質(zhì)中的光路35微米的球面像差，在圖4（b）的熒光信號(hào)。比例尺表示在圖4中的每一個(gè)的圖像的長(zhǎng)度為10微米。
近日，光學(xué)制造商已經(jīng)解決了這個(gè)問題通過用水作為物鏡浸泡介質(zhì)的物鏡設(shè)計(jì)。對(duì)于水樣品，浸泡和采樣介質(zhì)的折射率匹配使得球面像差的成像深度無(wú)關(guān)。這使得這些物鏡，深受工作距離許可證，動(dòng)輒數(shù)百微米到樣品收集到的圖像。這種設(shè)計(jì)的成功是圖4所示的（（c）和（d）項(xiàng)），顯示圖像與F-Tf的標(biāo)記的細(xì)胞，收集為零（圖4（c）），或66微米到水性介質(zhì)中（圖4（D）），用開水浸泡60倍平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡物鏡。在此，水溶液樣品介質(zhì)的光的路徑，通過熒光信號(hào)的影響。這種新一代的高數(shù)值孔徑，平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡水浸泡物鏡顯著幫助共聚焦顯微鏡在三維生物成像實(shí)現(xiàn)其潛力。
這種水浸泡的物鏡的色彩表現(xiàn)介于油浸平場(chǎng)氟和前面討論過的平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡物鏡。的玻璃表面的反射，在圖5（a）可看出，647納米的光被聚焦約488納米的光的0.6微米以上的上半部分的橫截面的圖像。卷收集了類似的模式為0或63微米到含水介質(zhì)中表明，這種差異是獨(dú)立的成像深度。
左下的圖像，在圖5中的（a）示出的遠(yuǎn)紅光的圖像的這種顏色的差異導(dǎo)致的三重標(biāo)記的珠被移位的紅色或綠色的熒光圖像。在熒光珠的圖像中，520納米的排放量都顯示為綠色，600納米紅色，680納米（遠(yuǎn)紅光）的排放量在藍(lán)色的排放。在此面板中的右下部演示蓋玻片厚度校正球面像差最小化，在這種物鏡的極端重要性。由于球面像差的校正取決于通過蓋玻片的光路的長(zhǎng)度，它是根據(jù)蓋玻片的厚度被設(shè)置領(lǐng)子調(diào)節(jié)。當(dāng)左方的橫截面的胎圈收集的衣領(lǐng)設(shè)置為測(cè)得的蓋玻片厚度（174微米），在右側(cè)的圖像采集與衣領(lǐng)錯(cuò)誤調(diào)整到150微米。結(jié)果從不當(dāng)彩色設(shè)置嚴(yán)重衰減的熒光信號(hào)，并損害垂直分辨率的球面像差。雖然這種失調(diào)選擇戲劇化一點(diǎn)，我們強(qiáng)調(diào)的是，這樣的錯(cuò)誤很容易，因?yàn)樵趯?shí)踐中遇到的實(shí)際厚度蓋玻片可以圍繞其標(biāo)稱值相差超過40微米。正確的衣領(lǐng)設(shè)置只能確保通過測(cè)量單個(gè)蓋玻片。在圖5（a）中的所有圖像，焦距軸是垂直方向，比例尺表示的距離為1微米。
在圖5中（b）和圖5（c）所示的圖像是一個(gè)字段的兩個(gè)F-Tf和Cy5標(biāo)記 - 蛋白標(biāo)記的細(xì)胞，并收集到水性緩沖液中為63微米的深度處。圖中標(biāo)尺為10微米，在這兩個(gè)圖像。雖然圖像出現(xiàn)尖銳的，這一物鏡的軸向色差的F-Tf的和Cy5-Tf的分布出現(xiàn)離散的（圖5（b））的效果。盡管如此，這些細(xì)胞的圖像的垂直一系列的投影（圖圖5（c）），表明兩個(gè)探針同樣標(biāo)注全部?jī)?nèi)涵體。在與圖5中所示的反射圖像（一），軸向色差也同樣明顯的圖像中的內(nèi)涵體零微米的深度處（在蓋玻片表面）收集。差別不大的在焦平面上的紅色和綠色熒光圖像中的內(nèi)涵體標(biāo)記的TF結(jié)合到熒光素和若丹明（圖6（一）），但F-Tf的和Cy5-Tf的觀察再次出現(xiàn)標(biāo)簽內(nèi)涵體的離散人口（圖6（b）條）。
兩個(gè)探頭的分布，可以得到更好的允許時(shí)，焦平面的差異，并用熒光素圖像收集深0.6微米結(jié)合Cy5的-Tf的圖像進(jìn)行比較。現(xiàn)在很明顯的內(nèi)涵體示于圖6（c）在恒定的黃色兩個(gè)探頭的共定位。采集圖像（圖6（d）和圖6（五））在一個(gè)單一的焦平面中所示的兩個(gè)探針的分布明顯的差異消失Cy5的-Tf的圖像進(jìn)行比較時(shí)收集的F-Tf的圖像，深0.6微米（圖6（f）條）。圖中標(biāo)尺為10微米的長(zhǎng)度在圖6（a）至圖6（c）中，對(duì)應(yīng)圖6（2）通過圖6（六）中的5微米。
色像差的影響，也可以通過測(cè)量圖像中的內(nèi)涵體標(biāo)記與多個(gè)探針的熒光比量化。比直方圖的半對(duì)數(shù)圖在圖7（a）與FR-TF標(biāo)記細(xì)胞，采集的圖像使用100X平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡（紅色曲線），40X平場(chǎng)氟（藍(lán)色曲線），和60倍的平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡水浸物鏡（綠色曲線）。圖7（b）顯示與F-Tf的和Cy5-Tf的標(biāo)記，使用相同的三個(gè)物鏡的細(xì)胞的比率直方圖。圖7（a）可以看出，若丹明熒光素的比例（紅色到綠色）的排放量是合理的恒定的所有三個(gè)物鏡。與此相反，圖7（b）示出100倍的俯視復(fù)消色差透鏡，雖然仍顯示變化最小的Cy5的熒光素的比例（遠(yuǎn)紅色到綠色），60倍的水浸泡俯視復(fù)消色差透鏡能顯示出更多的變化，和40倍氟顯示的平場(chǎng)甚至更多。60x平場(chǎng)的復(fù)消色差透鏡和40x平場(chǎng)氟色差的影響更加明顯，當(dāng)為一個(gè)單一的焦平面的分布進(jìn)行比較，以突起的垂直圖像序列的每一個(gè)物鏡（圖7（c）和圖7中所測(cè)量（四），分別）。在每一種情況下，在所投影的圖像的熒光比分布窄報(bào)告幾乎是恒定的比例，在核內(nèi)體中的兩個(gè)探頭在任何單一的焦平面的圖像，這是不正確的。
研究提出了色差和球面像差如何生動(dòng)地展示危及聚焦成像性能。在同一時(shí)間，他們強(qiáng)調(diào)物鏡的選擇，在共聚焦顯微鏡的極端重要性。差的顏色校正將導(dǎo)致錯(cuò)誤的解釋的相對(duì)分布的多個(gè)探頭，激光共聚焦顯微鏡的主要應(yīng)用之一。比量化還演示了如何的色差妥協(xié)顯微鏡定量。球面像差造成的不匹配的浸泡和樣品介質(zhì)惡化垂直分辨率和完全可以抹殺熒光檢測(cè)。雖然尤為明顯，激光共聚焦顯微鏡中的高對(duì)比度的圖像，這些錯(cuò)誤也損害常規(guī)落射熒光和透照技術(shù)所收集的圖像。
主要特點(diǎn)一直紫外線熒光色差。其他研究結(jié)果表明重大軸向色差遠(yuǎn)紅為好，越來(lái)越多地使用顯微鏡的發(fā)展新遠(yuǎn)紅熒光探針和激光能夠激動(dòng)人心的范圍。盡管這些研究提出涉及表征點(diǎn)源容易地顯示，這些樣品的問題，這將是更廣泛的探頭清單（但不一定有明顯）。這樣的探針包括胞漿中經(jīng)常使用的熒光比率測(cè)量離子濃度的染料。
例如，由488納米的光激發(fā)熒光SNARF-1胞漿pH指示劑，pH值的測(cè)量是從熒光的比值在580納米到640納米。對(duì)于薄的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH值的測(cè)量，這是容易想象有可能會(huì)受到的單元格的位置，相對(duì)于單獨(dú)的焦平面綠色的激發(fā)光，紅光和遠(yuǎn)紅光發(fā)射熒光的比率。雖然這些錯(cuò)誤經(jīng)常會(huì)簡(jiǎn)單地增加測(cè)量（兩倍或三倍提出的量化標(biāo)準(zhǔn)偏差）的變化，他們也可以系統(tǒng)性影響比測(cè)量，例如，當(dāng)比較不同厚度的不同部位的細(xì)胞的比例。
色差的最終后果，雖然不是這里討論的，是如何影響熒光檢測(cè)。在共聚焦系統(tǒng)的色差，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)一個(gè)卷不同的卷的成像結(jié)果之間的差異，熒光信號(hào)的衰減。對(duì)于束掃描系統(tǒng)（大部分共聚焦顯微鏡）離軸距離與信號(hào)惡化，這方面的損失共焦針孔成像點(diǎn)聚焦越走越遠(yuǎn)。
必須強(qiáng)調(diào)的是，這些觀察結(jié)果不是唯一的，以用于在所給出的數(shù)據(jù)，或特定制造商的具體物鏡。刻畫的彩色校正相同再現(xiàn)60倍水浸泡的物鏡，并在三個(gè)例子，兩個(gè)例子既的Quantum和DIAPHOT顯微鏡看臺(tái)上100倍油浸物鏡。從每一個(gè)主要制造商的物鏡已確定在顯著的軸向色差。事實(shí)上，無(wú)處不在的色差地址色差通過實(shí)行特殊輔助矯正鏡片，或完全避免折射和反映物鏡轉(zhuǎn)向替代顯微鏡設(shè)計(jì)的發(fā)展。盡管如此，光學(xué)顯微鏡可能繼續(xù)發(fā)展，并初步經(jīng)驗(yàn)，CFI60光學(xué)系統(tǒng)新一代的尼康公司表示，軸向色差校正大為改善。
從表面上看，它可能會(huì)出現(xiàn)一些物鏡僅僅是比別人更好。然而，如前面所討論的，物鏡的設(shè)計(jì)代表了一種妥協(xié)的設(shè)計(jì)參數(shù)。因此，每一個(gè)物鏡的反映出一組不同的設(shè)計(jì)妥協(xié)，根據(jù)物鏡應(yīng)用。盡管如此，它是可能的，研究人員將需要比目前可在光學(xué)設(shè)計(jì)，迫使它們來(lái)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，不進(jìn)行拉伸的物鏡設(shè)計(jì)的限制。
如果油浸物鏡必須使用在水性介質(zhì)中的圖像的樣品 - 例如，在活細(xì)胞的研究 - 球面像差可以通過最大限度地減少通過在水性介質(zhì)中的光路，或通過使用油狀的折射率，可以最小化適合的球面像差引起的光路水溶液。
色差問題，可以盡量減少在幾個(gè)方面。如果一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)中需要使用一個(gè)物鏡的具有顯著的色差，最明顯的解決方案是簡(jiǎn)單地避免了使用遠(yuǎn)紅熒光的染料如Cy5的共。在本次審查討論的結(jié)果證明所有的測(cè)試物鏡之間的綠色和紅色熒光令人滿意的協(xié)議。在一般情況下，最好是使用染料與某個(gè)特定的物鏡已得到糾正附近的特定波長(zhǎng)的最大激發(fā)和發(fā)射。第二個(gè)解決方案，如上所述，是，收集每個(gè)熒光圖像在垂直焦平面系列，并結(jié)合不同顏色的圖像，根據(jù)焦平面兩者之間的差異。這是一個(gè)簡(jiǎn)單的解決方案，但不會(huì)是適當(dāng)?shù)目焖賵D像采集時(shí)，是必要的，因?yàn)榕c活細(xì)胞。此處未示出的分析也表明，這種解決方案不具有足夠的精度，以用于校正圖像比定量。（或更少普及）甲更昂貴的解決辦法是使用雙光子顯微鏡，本質(zhì)上是由色像差的影響，只要沒有檢測(cè)針孔用于。然而，它的多色能力只有現(xiàn)在正在探索。