尼康顯微鏡：EPI-熒光照明光路

直到最近，熒光照明是一個(gè)選項(xiàng)僅適用于配備專(zhuān)門(mén)的高數(shù)值孔徑物鏡的研究級(jí)復(fù)合顯微鏡。這一技術(shù)在立體顯微鏡的需要不斷升級(jí)與引進(jìn)的編碼基因和生物特異性熒光蛋白GFP（綠色熒光蛋白）等。

體視顯微鏡的應(yīng)用GFP觀察現(xiàn)在是如此普遍，立體聲熒光照明，更經(jīng)常被稱(chēng)為GFP照明，即使他們可以利用許多其他應(yīng)用在生命科學(xué)和電子制造業(yè)。大幼蟲(chóng)，線蟲(chóng)，斑馬魚(yú)，卵母細(xì)胞和成熟的昆蟲(chóng)標(biāo)本，如可以方便地選擇和操作時(shí)，他們GFP標(biāo)記的照亮熒光技巧。熒光照明揭示生物體產(chǎn)生熒光蛋白耦合到一個(gè)大領(lǐng)域的視野和充足的工作距離和立體視覺(jué)，使觀察員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用鉗子，移液器，或顯微操作。其他更傳統(tǒng)的標(biāo)本也很容易觀察和記錄使用立體顯微鏡熒光照明。

落射熒光照明功能的方式是類(lèi)似上采用更復(fù)雜的復(fù)合顯微鏡體視顯微鏡上。通常情況下，在熒光照明器由包含在經(jīng)由中間管（或垂直照明，其安裝到顯微鏡外部燈箱的氙燈或汞弧燈，見(jiàn)圖1和2）之間的的顯微鏡放大本體和觀察管定位。目前僅限于這種類(lèi)型的照明采用共同的主要物鏡（CMO）立體顯微鏡的應(yīng)用，因?yàn)樗皇强梢允褂玫氖惺鄣牧慵赃m應(yīng)一個(gè)的格里諾或聚光型體視顯微鏡熒光照明。

弧燈產(chǎn)生的光被引導(dǎo)通過(guò)一個(gè)可調(diào)節(jié)的聚光透鏡的組合過(guò)濾器塊（圖2和圖3中示出），它允許唯一的光具有特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)（或帶通），通過(guò)容納在激發(fā)濾光片。過(guò)濾的光，然后通過(guò)顯微鏡成像的下部的顯微鏡（放大的身體和客觀的在體視顯微鏡）的路徑和到標(biāo)本偏轉(zhuǎn)，也調(diào)諧到選擇性地過(guò)濾由二色鏡，反射，和/或發(fā)送一個(gè)特定的波長(zhǎng)區(qū)域設(shè)置。的術(shù)語(yǔ)二色性（或二色性）是指過(guò)濾器或反射鏡的能力來(lái)區(qū)分兩種顏色的范圍，超過(guò)該限制反射特定波長(zhǎng)極限以下的顏色，而這些波長(zhǎng)發(fā)送。

聚焦的激發(fā)光通過(guò)顯微鏡放大主體和物鏡，在那里形成一個(gè)倒錐形的照明，沐浴試樣，令人興奮的任何存在的熒光基團(tuán)，并且有對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)的帶通范圍內(nèi)的吸收帶的。二次熒光發(fā)射（通常比的激發(fā)光更長(zhǎng)的波長(zhǎng)）從試樣發(fā)出的捕捉體視顯微鏡的常見(jiàn)的主要物鏡，并通過(guò)放大機(jī)構(gòu)和阻擋濾波器直接回，塊激發(fā)波長(zhǎng)，并只允許一個(gè)選定的區(qū)域發(fā)射波長(zhǎng)通過(guò)。在圖1和圖2中的顯微鏡體管構(gòu)成，波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光發(fā)射光通過(guò)左側(cè)和右側(cè)的放大光信道傳遞到達(dá)落射熒光照明器之前獨(dú)立地集中。光從左邊的通道直接穿過(guò)屏障過(guò)濾器前觀察管或直接進(jìn)入到相機(jī)端口。與此相反，右聲道的光從第一行駛回然后通過(guò)二色鏡的屏障過(guò)濾器和目鏡。此燈不到相機(jī)端口的途徑，只能用于觀察標(biāo)本。

列于圖2和3的熒光過(guò)濾器的組合塊的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。每個(gè)塊包含一個(gè)單一的激發(fā)濾光器，兩個(gè)屏障過(guò)濾器和一個(gè)二色鏡。汞弧燈產(chǎn)生的光通過(guò)激發(fā)濾光片進(jìn)入塊，如上所討論的，圖3中所示的二色性反射鏡的表面被反射。次級(jí)熒光發(fā)射通過(guò)阻擋過(guò)濾器。激發(fā)光濾光片，二色鏡，用于左聲道的屏障過(guò)濾器粘到的地方，但是，用于右聲道的屏障過(guò)濾器被安裝在一個(gè)小的幀可以通過(guò)擰松固定螺釘?shù)囊唤M從塊中刪除。卸下屏障過(guò)濾器框架允許訪問(wèn)定位在過(guò)濾器內(nèi)的塊的二色鏡。當(dāng)粘合成塊，更換過(guò)濾器小心，不要蔓延到過(guò)濾器表面的膠水和不持有的過(guò)濾器或雙色鏡用沒(méi)戴手套的手，以避免污染的表面油膩指紋。

熒光垂直照明可以容納三濾的塊和一個(gè)直徑過(guò)濾虛擬塊（沒(méi)有過(guò)濾器），使正常的明場(chǎng)觀察。過(guò)濾器塊被安裝在滑動(dòng)架中，并且可以被插入到光路中，是用來(lái)控制齒條位置的桿通過(guò)。每個(gè)塊都有一個(gè)附帶的識(shí)別板，其可插入順序排列，以使操作者能夠容易地選擇適當(dāng)?shù)膲K，用于熒光觀察的照明裝置的外部殼體上的插槽。

目前，尼康提供一個(gè)適度的過(guò)濾器組合的陣容，這是表1中列出。這些過(guò)濾器涵蓋了廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射條件，應(yīng)該是有用的許多普遍使用的熒光探針在生物學(xué)研究。該過(guò)濾器的組合，也適用于工業(yè)應(yīng)用，如熒光照片污染集成電路晶片檢查抗蝕劑聚合物。激發(fā)波長(zhǎng)介于380和510納米熒光探針，可以用來(lái)選擇合適的激發(fā)/發(fā)射過(guò)濾器組合（見(jiàn)表1）。該過(guò)濾器的組合也是非常有用的研究，采用各種綠色熒光蛋白的突變體，包括青色和藍(lán)色的版本。

在活的細(xì)胞培養(yǎng)物，具有熒光蛋白標(biāo)簽，可以顯著提高的信號(hào)強(qiáng)度，過(guò)濾器的組合時(shí)，是嚴(yán)格匹配的熒光激發(fā)和發(fā)射的檔案。例如，在DS-紅信號(hào)，視覺(jué)和圖像傳感器檢測(cè)到的紅色熒光的情況下，可以顯著提高的紅色信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)移更多的橙色發(fā)射。此外，專(zhuān)為植物標(biāo)本具有強(qiáng)烈的自體熒光背景葉綠素排放的過(guò)濾器組合往往受益于仔細(xì)和精確的選擇過(guò)濾器的規(guī)格，就到相應(yīng)的信號(hào)發(fā)射。顯微鏡工程師采取許多這些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)考慮到他們正在優(yōu)化波長(zhǎng)帶通過(guò)濾器組合體視顯微鏡地區(qū)。

體視顯微鏡熒光濾光片組合

表1

組合塊過(guò)濾器和其它敏感的干涉濾光片，將隨時(shí)間而變質(zhì)時(shí)暴露在高強(qiáng)度的光，紫外線的波長(zhǎng)。作為帶通頻率和傳輸值的特性，例如，如果過(guò)濾器被暴露于高濕度條件下也可能受到影響。為了增加這些過(guò)濾器的使用壽命，他們應(yīng)該被儲(chǔ)存在干燥器中或含有干燥劑的密封容器中。另外，還可減少光通過(guò)過(guò)濾器的保持照明快門(mén)關(guān)閉標(biāo)本時(shí)不被直接觀察或用數(shù)碼或膠卷的照相機(jī)系統(tǒng)成像的時(shí)間量。該過(guò)濾器只應(yīng)用干燥空氣清潔從耳氣球，軟駝刷，或無(wú)油的加壓氣瓶。不要試圖擦拭鏡頭紙過(guò)濾器，以避免劃傷或擦傷，軟干擾涂層的表面。

尼康SMZ1500如用立體顯微鏡，廣泛的標(biāo)本，可以在熒光照射下成像。物鏡的放大倍率為0.5倍至15倍的1.6倍的變焦跨度，在顯微鏡能夠540X，考慮到的一個(gè)經(jīng)典的化合物顯微鏡體視顯微鏡觀察范圍內(nèi)，共提供4倍的倍率廣度。這種廣泛的緯度使顯微鏡的放大倍率形象都大活標(biāo)本和熒光標(biāo)記的薄切片在顯微鏡玻片上安裝微小的細(xì)節(jié)上。熒光觀察的高倍率范圍內(nèi)的一個(gè)例子示出在圖4中的三重標(biāo)記的小鼠腎組織的粗節(jié)。標(biāo)記的Alexa Fluor 488的WGA，用DAPI的Alexa Fluor 568（得自Molecular Probes公司的Alexa Fluor探針和試樣）試樣，并使用三個(gè)過(guò)濾器的組合列于表1：藍(lán)綠色熒光蛋白/ DAPI，成像賦予GFP的帶通濾波器，和TRITC DsRed的。此圖片清楚地說(shuō)明了高倍率能力原本準(zhǔn)備復(fù)合顯微鏡觀察標(biāo)本的熒光體視顯微鏡。

其他體視顯微鏡制造商提供替代照明策略，激發(fā)和觀察。最流行的配置，如圖5所示，熒光激發(fā)，不利用顯微鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)包括一個(gè)外部通路。照明從電弧燈箱的第一通過(guò)激發(fā)濾光片，然后通過(guò)管定位在主顯微鏡主體的后部。管的下部配備的透鏡系統(tǒng)，引導(dǎo)到樣品上的激發(fā)光波長(zhǎng)。此配置可確保光線被直接引導(dǎo)到標(biāo)本在所有倍率變焦位置，提供所有倍率同樣強(qiáng)烈的熒光照明均勻暗背景。

從被捕獲的標(biāo)記的試樣中熒光發(fā)射通過(guò)的共同的主要物鏡（圖5），并通過(guò)變焦頻道和屏障過(guò)濾器定位在顯微鏡頭成一組。從那里時(shí)，光被引導(dǎo)到目鏡直接觀察或成數(shù)字成像或顯微攝影攝像管。此配置中的主要好處是缺乏的二色性反射鏡的一個(gè)要求，和獨(dú)立于預(yù)先配置的過(guò)濾器的組合塊，這使得研究者有所更自由地進(jìn)行過(guò)濾器的選擇。但是，配置也可能導(dǎo)致錯(cuò)誤，缺乏經(jīng)驗(yàn)的運(yùn)營(yíng)商試圖觀察標(biāo)本不正確的過(guò)濾器組合。

強(qiáng)烈的紫外線輻射所產(chǎn)生的汞弧燈作為光源，在熒光顯微鏡利用觀察者的眼睛的視網(wǎng)膜，可以造成損壞。為了避免這種情況，許多顯微鏡制造商包括保護(hù)裝置在顯微鏡體，可過(guò)濾紫外線光洗澡標(biāo)本在顯微鏡舞臺(tái)上。其他的安全預(yù)防措施，包括紫外線阻隔過(guò)濾器觀察路徑和雜散光保護(hù)周?chē)臒粝洹４送?，假人過(guò)濾運(yùn)營(yíng)商往往是空置過(guò)濾器的位置插入熒光干擾過(guò)濾器滑塊和旋轉(zhuǎn)框架設(shè)計(jì)。

熒光體視顯微鏡通常配備停止定位介于汞燈箱和阻擋有害紫外線輻射的垂直照明從燈標(biāo)本時(shí)不被觀察或成像光。此停止應(yīng)始終被插入光路時(shí)，不進(jìn)行觀測(cè)。

反射，或熱點(diǎn)可以發(fā)生在使用復(fù)消色差物鏡更高的放大倍率（1.6倍至2.0倍）的標(biāo)本，在熒光立體顯微鏡觀察時(shí)的視場(chǎng)的下部。此神器通常是唯一可見(jiàn)的變焦比率較低時(shí)，往往消失的變焦倍數(shù)增加。在大多數(shù)情況下，反射問(wèn)題不發(fā)生較低倍物鏡（0.5X和1.0X），無(wú)論光學(xué)校正因子，通常缺席下校正（消色差透鏡和計(jì)劃消色差透鏡）的高倍率物鏡。

存在范圍廣泛的應(yīng)用程序熒光調(diào)查，利用體視顯微鏡，列于表2。受益于這種觀察模式標(biāo)本的數(shù)量是相當(dāng)大的，涵蓋廣泛的學(xué)科，包括那些從生物領(lǐng)域到工業(yè)制造商不等。

熒光立體顯微鏡的應(yīng)用

表2

熒光觀察在立體顯微鏡提供的獨(dú)特的屬性的三維觀察時(shí)相比，提出的一個(gè)古典化合物顯微鏡的視圖。此外，更大的工作距離和景深立體技術(shù)所提供的啟用更寬的全景視圖字段和更強(qiáng)烈的熒光。這些功能是巨大的利益，調(diào)查人員正試圖處理大量的生物標(biāo)本和材料的技術(shù)人員正在開(kāi)展準(zhǔn)備工作，如嵌入，電子檢查，或切割。作為更清楚地定義的過(guò)濾器組合成為可用于專(zhuān)門(mén)的應(yīng)用程序，利用熒光立體顯微鏡繼續(xù)攀升。