奧林巴斯顯微鏡：暗場顯微鏡的照明

我們所有的人都相當(dāng)熟悉的外觀和知名度的恒星在一個漆黑的夜晚，盡管他們從地球上的巨大距離。明星可以很容易地觀察到夜間，主要是因為微弱的光線和黑色的天空形成了鮮明的對比。

但是星辰都閃耀著都晚一天，但他們白天是看不見的，因為壓倒性的亮度的太陽“鋪天蓋地”從星星微弱的光線，使他們看不見。在日全食期間，月亮進(jìn)入地球和太陽之間的太陽和星星的光擋住了，現(xiàn)在可以看到，即使是白天?？傊?，對一個黑暗的背景暗淡的恒星光的知名度，極大地提高。

這一原則適用在暗視野（也稱為darkground）的顯微鏡未染色透明標(biāo)本清晰可見，一個簡單而常用的方法。這樣的對象通常具有非常接近的值與其周圍環(huán)境的折射率，并在常規(guī)的明視野顯微鏡難以成像。比如，許多小的水生生物的取值范圍從1.2至1.4的折射率，從而在從周圍的水介質(zhì)中的光程差可以忽略不計。這些暗場照明的理想人選。

暗場照明要求擋住了中央的光通常通過左右（前后）試樣，只允許斜光線從各個方位，以“罷工”的顯微鏡載玻片上鑲嵌的試樣。一個簡單的阿貝暗場聚光透鏡頂部的凹球面狀，讓光線從表面在所有方位新興頂點(diǎn)集中在試樣平面形成一個倒置的中空錐光。如果沒有試樣本和聚光鏡的數(shù)值孔徑超過物鏡的傾斜射線交叉和所有這樣的光線進(jìn)入的物鏡，因為他們的傾角會錯過。視野會變暗。

暗場聚光鏡/物鏡對圖1中所示的是一個高數(shù)值孔徑的安排，表示在其最先進(jìn)的配置，這將在下面詳細(xì)討論的暗視野顯微鏡。的物鏡包含一個內(nèi)部的可變光闌的作用是降低的物鏡的數(shù)值孔徑值低于倒中空發(fā)射的光錐通過聚光鏡。心形電容是反射的暗場的設(shè)計依賴于內(nèi)部的鏡子，投射到標(biāo)本平面無像差的光錐。

上滑動，特別是未染色的，非光吸收試樣，當(dāng)試樣被放置的傾斜射線穿過試樣，衍射，反射和/或折射光的不連續(xù)性（如細(xì)胞膜，細(xì)胞核，和內(nèi)部的細(xì)胞器）讓這些微弱的光線進(jìn)入物鏡。標(biāo)本否則黑色的背景上，然后可以看到明亮。暗場照明在傅里葉光學(xué)方面，消除零階（未散射光）的衍射圖案，形成在后側(cè)焦點(diǎn)面上的物鏡。這會導(dǎo)致形成的圖像中完全從試樣散射的高階衍射強(qiáng)度。

圖2中的顯微照片說明暗場和明照明的效果，在整個安裝試樣從一個小海洋原生動物（放射）的二氧化硅骨架。在普通明場，放射蟲的骨骼特征是沒有得到很好的定義，往往無論是與傳統(tǒng)的膠片或數(shù)字捕獲顯微照片記錄被淘汰。與聚光鏡孔徑光闌收到一個點(diǎn)的衍射工件模糊的一些示例的細(xì)節(jié)，在圖2（a）的顯微照片拍攝于明照明。這增強(qiáng)了圖像失真為代價的標(biāo)本的對比。暗場照明下（圖2（b）），更詳細(xì)地存在，特別是在上部的有機(jī)體，并且圖像獲取一個明顯的三維外觀。放射需要用暗場停止（圖2（c））一起使用時，紅色濾光片，豐富多彩的外觀，更令人愉快，雖然沒有產(chǎn)生的附加詳細(xì)信息，甚至還有一些圖像質(zhì)量的降低。

標(biāo)本有光滑的反射面產(chǎn)生的圖像，由于部分反射光到物鏡。在從周圍介質(zhì)中，或發(fā)生的折射率梯度（在邊緣的膜）的折射率不同的情況下，光的折射的試樣。這兩種情況下，反射和折射產(chǎn)生的光的方向的相對較小的角度變化，允許一些進(jìn)入物鏡。與此相反，一些光撞擊試樣也是衍射，穿過整個物鏡的數(shù)值孔徑范圍內(nèi)的光，產(chǎn)生一個180度的弧。的物鏡的分辨能力是相同的明視場條件下所觀察到的，但在暗場照明的圖像的光學(xué)字符不是忠實(shí)地再現(xiàn)（除非利用一個專門設(shè)計的可變光闌時降低的有效數(shù)值孔徑與高倍率油浸專為暗視野顯微鏡物鏡）。

在上述的例子中的星光的可見性也大大提高了由光輝試樣和暗環(huán)繞之間的對比度。如上所述，在暗場照明發(fā)生了什么事是所有通常不偏離的零階射線不透明站已被封鎖。斜射線衍射試樣，得到第一，第二，和更高衍射級的物鏡，請他們與試樣以產(chǎn)生圖像干擾到成像面的后側(cè)焦點(diǎn)面。

暗場照明的理想人選包括分鐘的水生生物，微生物，硅藻，小昆蟲，骨，纖維，頭發(fā)，未染色的細(xì)菌，酵母，細(xì)胞組織培養(yǎng)，和原生動物。非生物標(biāo)本包括礦物和化學(xué)晶體，膠體顆粒，灰塵計數(shù)標(biāo)本，而薄的部分聚合物和陶瓷含有細(xì)小的夾雜物，孔隙度的差異，或折射率梯度。準(zhǔn)備暗視野顯微鏡標(biāo)本時，應(yīng)謹(jǐn)慎，因為躺在焦點(diǎn)平面的上方和下方的功能也可以散射光線，有助于圖像退化。用試樣的厚度和顯微鏡載片上的厚度也是非常重要的，在一般情況下，薄的試樣衍射工件，可以干擾圖像形成期望消除的可能性。

圖3中所示臺下聚光鏡展示一個不透明的光路徑上停止的效果，通過一個簡單的折射聚光鏡。在左側(cè)（圖3（a）），是一個典型的阿貝明場聚光鏡的位置與打開以最大限度地提高光錐的數(shù)值孔徑的孔徑光闌。來自源的光通過光闌，然后通過幾個透鏡元件折射，形成一個倒錐形的光的數(shù)值孔徑約1.20。低于完全打開的孔徑光闌，當(dāng)一個不透明的蜘蛛式燈停止（圖3（b））插入的中心的光線被阻擋，只允許周圍光線通過透鏡，以形成一個倒置的斜中空的光錐數(shù)值孔徑（1.20）沒有變化。照明空心光錐是由光折射在周長鏡片，光學(xué)矯正往往是最窮的。即使如此，聚光鏡將充分履行使用低倍率的物鏡，進(jìn)行定性暗場工作產(chǎn)生非常好的結(jié)果。對于更為精細(xì)量化顯微鏡，有必要使用消球差的聚光鏡（色差和球面像差的校正），通過產(chǎn)生的圖像更清晰的細(xì)節(jié)和更可靠的功能性能要好得多。

在暗視野顯微鏡，如果你是通過背面的物鏡伯特蘭鏡頭或望遠(yuǎn)鏡相看，它似乎充滿光明。這種微弱的衍射光改組為目鏡膜片的平面與可見光圖像的對比度逆轉(zhuǎn)，在黑色背景上明亮的圖像。由于暗視野顯微鏡消除明亮的不偏離的光，這是非常浪費(fèi)的光照明形式，并因此要求高強(qiáng)度的照明光源。顯微鏡載物片必須是適當(dāng)?shù)暮穸?，約1毫米+ / - 0.1毫米。玻片標(biāo)本在光路中的光學(xué)表面必須非常干凈，因為每一個的污垢斑點(diǎn)會無情地亮。

有幾件裝備，利用暗場照明。最簡單的是“蜘蛛”下底臺下聚光透鏡（前焦面）（圖3（b）和圖4（a））下停止。光圈和視場光闌敞開通過斜射線。中央不透明停止（你可以做一個透明的玻璃盤上安裝一個硬幣）塊中央的光線。這個裝置的工作原理相當(dāng)，甚至與阿貝聚光鏡（圖3），10倍的物鏡高達(dá)40倍或更高的物鏡不高于0.65的數(shù)值孔徑。不透光的光闌的直徑應(yīng)為10x物鏡的數(shù)值孔徑為0.25至約20-24毫米的20倍和40倍的物鏡接近0.65的數(shù)值孔徑大約為16-18毫米。

在圖4所示的停止集（一）大小不等，從8毫米到30毫米，并提供出色的暗視野不透明停止，幾乎所有的數(shù)值孔徑的物鏡（0.65以下）。個人站可以互換，簡單地通過除去螺釘?shù)牡撞恐沃┲敫鼡Q站與新的大小。的蜘蛛保持器的外尺寸會有所不同，這取決于在聚光鏡底部的殼體開口直徑。

在圖4中示出的光停止（b）是一種巧妙的“反向虹膜隔膜，來增加或減少的大小，在停止使用的操縱桿控制臂的膨脹和收縮。由于此桿轉(zhuǎn)動時，中央葉的大小的變化為約10毫米，25毫米直徑的，更高的放大倍率的物鏡創(chuàng)造更大范圍內(nèi)的停止。這種類型的可變光停止隔膜消除了需要用于改變光站的更高的功率的物鏡是，每次插入到光路中。它也有附加的優(yōu)點(diǎn)是在必要的點(diǎn)直徑，以達(dá)到最佳的性能，同時觀察試樣的略有不同的“可調(diào)”。雖然這些類型的隔膜光停止現(xiàn)在非常罕見，他們提供了一個獨(dú)特的方法，達(dá)到非常理想的效果，暗場照明。

幾乎任何明場實(shí)驗室顯微鏡可以很容易地轉(zhuǎn)換使用暗場照明。如上所述，中央不透明停止可以被塑造從一個小硬幣，紙板，塑料，或黑色的紙，可以放置在過濾器載體下方的聚光鏡（或用膠帶貼在聚光鏡底部），以阻止光線進(jìn)入前透鏡的物鏡。不透光的光闌的直徑會有所不同，從物鏡到物鏡，應(yīng)仔細(xì)測量在臺下上過濾器的載體，并保持穩(wěn)定的對聚光鏡的底部放置一個透明的標(biāo)尺。接下來，確定通過除去一個目鏡觀察使用相望遠(yuǎn)鏡（或通過插入一個勃氏鏡）的物鏡上面的后焦平面的圖像的標(biāo)尺的開口尺寸?？隙ǖ氖?，臺下聚光孔徑和視場光闌打開執(zhí)行這個動作之前，其最寬位置。標(biāo)尺隔板，顯示在后焦面的數(shù)量將等于到停止要阻止零階光進(jìn)入的物鏡的大小。切換到下一個最大規(guī)模的物鏡，并采取另一種測量，重復(fù)，直到停止尺寸已知的所有物鏡都。

近似不透光的光闌的大小與倍率指南表1中給出。的實(shí)際尺寸會有所不同，這取決于幾個因素，包括接近的停止相對于聚光鏡孔徑光闌，物鏡和聚光鏡，用于聚光鏡的像差校正的程度，和目鏡的視場數(shù)的數(shù)值孔徑。在確定停止的大小也很重要的是的聚光鏡后透鏡，目鏡倍率（放大倍率較小，需要稍微大一些的停止），和安裝介質(zhì)不同的直徑。停止的大小成比例地變化安裝介質(zhì)的折射率高的折射率需要一個更大的停止。干燥的坐騎也將需要一個更小的站比的水懸浮液。

視場光闌直徑大小

表1

使用剪刀或（優(yōu)選）的黃銅打孔器切一組相匹配的所有的物鏡的停止，明確乙酸乙酯一個堅固的片材或玻璃膠。乙酸鹽或玻璃基片應(yīng)該是很容易地安裝到臺下聚光的底面，可以通過一個過濾器保持器，或通過其他方式，如粘接帶。停止的對齊方式，可以通過觀察通過伯特蘭透鏡或卸下目鏡，同時調(diào)整聚光鏡中螺釘通過相位望遠(yuǎn)鏡觀看。

暗視野顯微鏡在高放大倍率

為了更精確的工作和黑背景，你可以選擇一個聚光鏡設(shè)計，尤其是暗場，即僅傳輸斜光線。有幾個品種：“干”暗場聚光鏡與空氣之間的聚光鏡頂部和底部的滑動-和浸泡一滴浸油的使用（一些被設(shè)計為使用水代替）的的暗視野聚光鏡需要建立聚光鏡頂部和底面的樣品載玻片之間的接觸。浸入式暗場聚光鏡，內(nèi)部鏡面，并通過射線偉大的斜率和無色差，產(chǎn)生最好的效果和最黑暗的背景。

也許是最廣泛使用的暗視野聚光鏡是拋物面，非常精確地由一塊實(shí)心的玻璃地面成拋物面的形狀，如圖5（b）中示出。將集中于一個拋物面聚光鏡的反射面（在圖5（b）的玻璃和聚光鏡殼體之間）的光入射在反射器的焦點(diǎn)處。最受歡迎的拋物面的聚光鏡被切斷，以確保焦點(diǎn)稍稍超出了聚光鏡頂部，使平行光線將聚焦在試樣的照明的位置，最大限度地提高。的光的玻璃聚光鏡的底部停在用來擋住到達(dá)試樣的中心射線。由聚光反射的光線角度高于反射的臨界角，并會聚在聚光鏡的主要焦點(diǎn)。載玻片上，安裝介質(zhì)，浸油的組合（聚光鏡和載玻片之間）完成的拋物面形狀的光學(xué)均勻性。

正如上面所討論的，干燥的暗視野聚光為0.75以下的數(shù)值孔徑（圖圖5（a））的物鏡是有用的，而拋物面形和心形的浸沒式聚光鏡（圖1和圖5（b）），可以使用非常高的數(shù)值的物鏡孔（高達(dá)1.4）。高于1.2的數(shù)值孔徑的物鏡，將需要一些工作光圈，因為他們的最大數(shù)值孔徑的減少可能會超過聚光鏡的數(shù)值孔徑，從而使直射光進(jìn)入物鏡。出于這個原因，許多高數(shù)值孔徑的用于暗場和明照明設(shè)計的物鏡是由一個內(nèi)置的調(diào)節(jié)可變光闌的孔徑光闌作為 這種數(shù)值孔徑的減少也限制了物鏡的分辨能力，以及在圖像中的光的強(qiáng)度。專門設(shè)計的暗場工作的專門的物鏡產(chǎn)生的最大數(shù)值孔徑接近暗視野聚光鏡的數(shù)值孔徑的下限。他們沒有內(nèi)部光闌，但是鏡頭卡口的直徑被調(diào)整以使至少一個內(nèi)部透鏡具有執(zhí)行作為孔徑光闌的最佳直徑。

表2列出了幾種最常見的反射高數(shù)值孔徑暗場聚光鏡。此表應(yīng)該被用來作為一個指南，當(dāng)選擇高數(shù)值孔徑的暗場應(yīng)用程序的使用的聚光鏡/物鏡組合。

高數(shù)值孔徑暗場聚光鏡規(guī)格

表2

如圖5所示的聚光鏡是專為生產(chǎn)高數(shù)值孔徑斜空心光錐暗場照明。在這兩種情況下，在聚光鏡的上表面的平面和垂直于光軸的顯微鏡。在左邊的聚光鏡（圖5（a））被設(shè)計為使用無油之間的聚光鏡和底面的顯微鏡載片上的“ 干 “。與此相反，在圖5（b）的拋物面聚光鏡的目的是“ 油 “的顯微鏡載片上的底部，直接指向下方的試樣。省略浸油，使用這種聚光鏡（或任何其他聚光鏡列于表2）時，將排除任何光線到達(dá)試樣。由這些聚光鏡發(fā)出的光線的傾斜的空心錐形不能擺脫頂端透鏡無油的情況下，將完全反射回進(jìn)入聚光鏡。從照明光源發(fā)射的光被反射的鏡面玻璃表面的聚光鏡，聚光鏡頂部排出，在高得多的傾斜角超過臨界角（約41度）的內(nèi)部發(fā)生全反射的光通過的內(nèi)從玻璃進(jìn)入空氣。的情況下，涂油拋物面聚光鏡（圖5（b）和表2中的聚光鏡）聚光鏡玻璃，浸油，玻璃載片的折射率相等，發(fā)射的光從聚光鏡通過試樣unrefracted玻璃-空氣界面。

反映高數(shù)值孔徑聚光鏡列于表2，涵蓋廣泛用于需要高倍率暗視野顯微鏡的光產(chǎn)生斜空心錐形設(shè)計。已經(jīng)在上面詳細(xì)討論的拋物面天線的暗視野聚光。另一個非常有用的設(shè)計是圖1中所示的心形電容。此的聚光鏡設(shè)計采用鏡像半球中停止的光與直射光的反射器到第二個反射面形狀類似于心革命，從聚光鏡源于它的名字，作為聚光鏡的中心。球形，心形反射面的結(jié)合，產(chǎn)生一個的聚光鏡是免費(fèi)從昏迷和球形和色差。有幾種技術(shù)的缺點(diǎn)，使用這種高數(shù)值孔徑的聚光鏡。心形電容對齊非常敏感，必須謹(jǐn)慎地利用非常尖銳的光錐，使最困難的暗場聚光鏡使用。此外，聚光鏡產(chǎn)生了顯著的眩光量，即使是從最微小的灰塵顆粒，短焦距，可能會導(dǎo)致照明差超過幾微米的尺寸或厚度的對象上。選擇定量高倍率暗視野顯微鏡顯微鏡載玻片時，請一定要選擇從玻璃無熒光雜質(zhì)的混合物，制成幻燈片。

高數(shù)值孔徑的反射暗場照明的聚光鏡（圖1，圖5，圖6和表2）與所選擇的方法為了觀察，拍攝非常小的顆?；蚰z體懸浮液的集合，即使當(dāng)粒徑明顯低于分辨率的極限了的物鏡。這是由于光衍射的粒子，通過物鏡，并成為作為可見明亮的衍射磁盤。每個粒子可見為一分鐘衍射磁盤，大于相鄰顆粒之間的橫向距離的物鏡的分辨能力的極限。作為照明強(qiáng)度增加時，光程差之間的分鐘的衍射顆粒和背景增加。同時，現(xiàn)在甚至更小的顆粒（單靠自己的能力散射光檢測）衍射足夠的光線變得可見，即使當(dāng)其直徑小于40納米，這是大約五分之一的200納米的分辨率極限，可以看出懸浮顆粒油浸物鏡的最高的數(shù)值孔徑。在生物應(yīng)用中，生活可以觀察和拍攝使用高數(shù)值孔徑的暗場聚光鏡的平均直徑約20納米（太小看出明或DIC照明）的細(xì)菌鞭毛運(yùn)動。

應(yīng)特別注意支付到注油高數(shù)值孔徑的聚光鏡的底部樣品載玻片的細(xì)節(jié)。這是非常困難的，以避免引入的微小氣泡到聚光鏡頂部透鏡的顯微鏡載片上的底部之間的區(qū)域中，此技術(shù)應(yīng)實(shí)行完美。氣泡會導(dǎo)致圖像的眩光和失真，對比度和整體形象退化導(dǎo)致的損失。使用顯微鏡載玻片，要么太厚或太薄時也遇到問題。許多暗場的聚光鏡中含有可用幻燈片的厚度范圍內(nèi)的聚光器支架上直接刻。如果滑動太厚，不采取較高的粘度浸油的情況下，往往是難以聚焦聚光。另一方面，太薄的幻燈片有分解傾向聚光鏡油之間的鍵和滑動。這是一個很好的主意，購買精密顯微鏡載玻片正確的厚度，以避免上述問題。

標(biāo)本浸泡在水溶液中一個獨(dú)特的情況出現(xiàn)時，正在使用高數(shù)值孔徑的暗場聚光鏡成像。在這些條件下的水溶液的折射率的限制下，光可以通過從入水（1.336 例）試樣周圍的玻璃顯微鏡載片上（1.515 例）的傾斜角度。的最大數(shù)值孔徑的光通過玻璃水是由下面的公式給出：

NA (illumination) = 1.555 × sin(i) = 1.336 × sin(90°)

and because sin(90°) = 1

NA (illumination) = 1.336

盡管反射的上限高的數(shù)值孔徑為1.50（見表2），設(shè)計用于浸油的暗場式聚光鏡列照明在含水介質(zhì)中的標(biāo)本的光必須具有不大于1.336，有效的減少了的數(shù)值孔徑暗場照明的上限。暗場照明的數(shù)值孔徑高的折射率的液體中浸漬的試樣的情況下，有效的上限可以接近最多為1.50，雖然這是在實(shí)踐中難以實(shí)現(xiàn)。

是否打算用于干性或油，高數(shù)值孔徑的聚光鏡，必須準(zhǔn)確地集中在顯微鏡的光路中，以實(shí)現(xiàn)最佳的性能。為了實(shí)現(xiàn)這一物鏡，許多暗視野聚光鏡構(gòu)建刻的上表面上，以幫助在中心聚光鏡與一個小圓圈。具有低功耗（10倍，20倍）物鏡進(jìn)行成像的刻圓定心，定心螺釘，以確保正確為中心的圓（和聚光鏡）的光路中使用的聚光鏡。暗場照明顯微鏡對準(zhǔn)的更多詳細(xì)信息，請咨詢我們的部分在其他地方暗視野顯微鏡配置顯微鏡底漆。

在一般情況下，在適當(dāng)條件下暗場照明成像的對象是相當(dāng)壯觀看（例如嘗試一滴新鮮血液暗場）。標(biāo)本通常含有非常低的固有對比度在明顯微鏡暗場大放異彩。這樣的照明是最好的暴露輪廓，邊緣，邊界，和折射率梯度。不幸的是，暗場照明內(nèi)部細(xì)節(jié)中透出的那么有用。

其他類型的標(biāo)本，包括許多染色，也很好地回應(yīng)暗場條件下的照明。圖7示出了三種類型的樣品，所有這些都產(chǎn)生良好的對比度在明場和暗場照明的暗場顯微照片。在體內(nèi)的鹿蜱（硬蜱demmini），在圖7（a）所示的詳細(xì)信息可在明洗滌，除非聚光鏡光圈縮小，以最大限度地提高對比度。然而，在暗視野中，大多數(shù)的標(biāo)本細(xì)節(jié)虱子變得可見，可以很容易地在膠片上拍攝的。重染寄生蟲吸蟲（棘revolutum，圖7（b））也發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的細(xì)節(jié)，暗場條件下照射時，蠶的氣管和氣門在圖7（c）所示。除了上述例子外，也可以被視為一些其他標(biāo)本，明場和暗場照明下拍攝，以達(dá)到預(yù)期的效果。

在上半年的20世紀(jì)，暗視野顯微鏡下面有一個非常強(qiáng)大的，在花費(fèi)了很大精力優(yōu)化暗場聚光鏡和照明的。這種強(qiáng)烈的興趣開始慢慢褪色的出現(xiàn)更先進(jìn)的對比增強(qiáng)技術(shù)，如相襯，微分干涉相襯，霍夫曼調(diào)制對比。最近，一個新的興趣已經(jīng)出現(xiàn)在傳輸?shù)陌狄曇帮@微鏡熒光顯微鏡結(jié)合使用時，由于自身的優(yōu)點(diǎn)。

暗視野顯微鏡仍然是生物和醫(yī)學(xué)研究的一個很好的工具。它可以有效地使用在高放大倍率拍攝生活的細(xì)菌，或在低倍率來查看和照片細(xì)胞，組織和整個坐騎。海洋生物學(xué)家在低權(quán)力繼續(xù)使用暗場照明，淡水和咸水生物，如藻類和浮游生物觀察和記錄數(shù)據(jù)。