徠卡顯微鏡 - 熒光壽命成像之FLIM-FRET應(yīng)用淺析

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一項基于熒光壽命（電子駐留在激發(fā)態(tài)的時間統(tǒng)計值）的顯微成像技術(shù)。與熒光光譜一樣，熒光壽命也是熒光物質(zhì)的一種內(nèi)在特有性質(zhì)，不受熒光物質(zhì)濃度、激發(fā)光強度等因素的影響。基于熒光壽命測量的 FRET 技術(shù)—— FLIM-FRET，具有 FLIM 和 FRET 兩者的優(yōu)勢，即能在不受熒光強度影響因素影響的條件下，在納米分辨率水平對蛋白互作進行研究，或者通過 FRET 探針研究分子環(huán)境變化，更重要的是其測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、易重復(fù)，接下來我們來看兩個例子。

今年發(fā)表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 細(xì)胞中的重要作用。

作者通過對免疫缺陷病人進行基因篩查，發(fā)現(xiàn)了 ZIP7 蛋白的缺失，利用 CRISPR-CAS9 技術(shù)構(gòu)建了該基因缺失的小鼠模型，并利用該模型證明了 ZIP7 缺失會導(dǎo)致 B 細(xì)胞發(fā)育受阻。ZIP7 介導(dǎo) Zn²⁺ 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入細(xì)胞質(zhì)，為了證明 ZIP7 缺失的細(xì)胞中 Zn2+ 濃度受到了影響，作者通過 FRET 探針 eCALWY-4、eCALWY-6 進行了研究，然而傳統(tǒng)的FRET技術(shù)會受到探針濃度的影響從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，因此作者利用了 FLIM-FRET 技術(shù)，證明 ZIP7 突變體細(xì)胞質(zhì)中 Zn2+ 濃度明顯下降，后續(xù)的實驗進一步證明了 ZIP7 調(diào)控的 Zn2+ 水平對 B 細(xì)胞發(fā)育的重要性。

FRET 探針不僅可用在細(xì)胞水平，in vivo 個體水平也同樣適用。

“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探針對小鼠小腸、胰腺等組織中的 Rac1 活性進行了監(jiān)測。然而，傳統(tǒng)的 FLIM 技術(shù)成像速度非常慢，在活體應(yīng)用時，由于時間分辨率不夠會導(dǎo)致數(shù)據(jù)的假象。該文通過算法將這種成像速度不夠?qū)е碌募傧筮M行了*大程度的消除，從而在一定程度上促進了 FLIM 在活體水平的應(yīng)用，該文章發(fā)表在2018年 eLife 雜志上。

當(dāng)然， FLIM 應(yīng)用并不僅限于 FLIM-FRET，通過 FLIM 還可以對樣本所處的微環(huán)境進行檢測、對樣品組份進行分離等等。在傳統(tǒng)的熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎(chǔ)上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度，大大拓展了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。

然而，正如 Sean C Warren eLife 文章所說，F(xiàn)LIM 成像速度慢是限制其應(yīng)用的*大瓶頸。

Leica*新 SP8 FALCON *快速熒光壽命成像解決方案，使 FLIM 成像速度提升了近10倍（較經(jīng)典 TCSPC 方法），近共聚焦的成像的速度幾乎能滿足所有動態(tài)過程的速度要求，可輕松實現(xiàn) XYZTλ 多方式快速熒光壽命成像。