徠卡顯微鏡：熒光定量

眼見為實(shí)-測(cè)量知道。這個(gè)方程反映在14 個(gè)世紀(jì)科學(xué)的發(fā)展，從自然哲學(xué)到現(xiàn)代科學(xué)同樣適用于熒光成像和生物科學(xué)技術(shù)。顯微鏡生成圖像不僅用于說明，但也量化。更先進(jìn)的技術(shù)使用照明模式（無圖像形成）或不會(huì)產(chǎn)生形象可言-但仍然是顯微技術(shù)。這些F-技術(shù)正變得越來越重要，在當(dāng)前生物科學(xué)。

的擾動(dòng)和松弛：FRAP和FPA

一個(gè)非常著名的化學(xué)和物理的方法是放松方法。測(cè)量的信號(hào)-在我們的例子中的熒光強(qiáng)度-平衡常數(shù)。-作為一個(gè)脈沖或跳的參數(shù)發(fā)生擾動(dòng)后，強(qiáng)度將改變，并達(dá)到新的平衡。動(dòng)力學(xué)的變化反映了該機(jī)制的細(xì) 節(jié)，排除競(jìng)爭(zhēng)的途徑。該計(jì)劃提供了一個(gè)優(yōu)雅的方式來測(cè)量熒光標(biāo)記分子的流動(dòng)性。如果該字段的一小部分是通過施加強(qiáng)烈的光線（脈沖擾動(dòng)）漂白，熒光將減少。情況下，分子是不能移動(dòng)的，漂白面積將保持黑色。如果熒光分子通過擴(kuò)散或通過活動(dòng)進(jìn)程，可以移動(dòng)，將再次恢復(fù)熒光漂白區(qū)域。因此，這個(gè)協(xié)議被稱為熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）。擬合模型曲線的松弛部分的信號(hào)所揭示的基本機(jī)制。和分?jǐn)?shù)的分子是不動(dòng)的（不動(dòng)的分?jǐn)?shù)）是來自于均衡信號(hào)電平的比值。

圖 1：時(shí)間在FRAP實(shí)驗(yàn)過程中的熒光強(qiáng)度。在一個(gè)感興趣的區(qū)域中，漂白后的熒光的強(qiáng)度恢復(fù)到一個(gè)新的平衡。恢復(fù)噸的1/2的一半時(shí)間，容易地提取從回收的動(dòng)力學(xué)。另外，不動(dòng)的部分漂白脈沖之前和之后的均衡強(qiáng)度的差異是明顯的。

FRAP通常用于測(cè)量在細(xì)胞中的擴(kuò)散過程。除了傳統(tǒng)的FRAP，有時(shí)會(huì)使用衍生工具：瓣，這是熒光漂白后虧損。在這里，漂白連續(xù)發(fā)生在一個(gè)地區(qū)，有沒有交集漂白面積。iFRAP表示整場(chǎng)除了一個(gè)小區(qū)域被漂白的方法。發(fā)現(xiàn)更多的縮略詞漂白方法，但這些都沒有實(shí)際意義。

技術(shù)上相似，但基于一個(gè)完全不同的機(jī)制，激活熒光蛋白實(shí)驗(yàn)。這些蛋白是熒光的，并可以由不同的照明顏色的接通和關(guān)斷?；蛘?，熒光發(fā)射光譜的變化后，開關(guān)照明。它的優(yōu)點(diǎn)是，人們可以對(duì)一個(gè)黑色的或不同顏色的背景中檢測(cè)到的熒光，并按照在細(xì)胞或組織（熒光蛋白激活FPA）的分子的擴(kuò)散或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

這些方法并不只適用于流動(dòng)性的測(cè)量，但也動(dòng)力學(xué)測(cè)量濃度的變化。最為人熟知的，如鈣離子指標(biāo)。莫代爾生物傳感器，往往基于FRET-FLIM的，允許各種各樣的細(xì)胞以被監(jiān)視的參數(shù)，其中包括代謝物的濃度和膜電位。

福斯特的相互作用：FRET

圖 2：如果發(fā)生福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的供體與受體的激發(fā)光譜，兩個(gè)分子重疊的發(fā)光光譜非常接近（幾埃）。時(shí)的距離一半的光子將被轉(zhuǎn)移由該過程被稱為福斯特半徑（通常為0.2?1納米）。

當(dāng)從熒光分子發(fā)射一個(gè)光子，波長(zhǎng)為斯托克斯位移紅色，即能量小于激發(fā)。如果第二個(gè)熒光分子（接受器）的第一個(gè)分子的排放物（捐贈(zèng)者D）的范圍內(nèi)的激發(fā)能的緊密接觸，能量被轉(zhuǎn)移的概率增加的距離的6 個(gè)功率不發(fā)射和吸收（無輻射）。這種現(xiàn)象進(jìn)行了分析，并首先正確描述西奧多·福斯特，因此被稱為福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。

一個(gè)直接的應(yīng)用FRET的受體后，僅捐助照明（敏排放SE）所發(fā)出的熒光分析。另外，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率由漂白的受體和供體熒光測(cè)量前，漂白后也被測(cè)量。如果發(fā)生FRET，捐助將更加明亮閃耀受體漂白后，沒有能量流動(dòng)的受體，因此所有的能量轉(zhuǎn)化為供體發(fā)射（受體漂白AB）。進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)證明蛋白質(zhì)相互作用，它們的相對(duì)距離。

FRET現(xiàn)象還利用現(xiàn)代生物傳感器。這些是（往往是復(fù)雜的）分子，含有的供體和受體。結(jié)合后，或感測(cè)目標(biāo)，該分子將經(jīng)歷構(gòu)象變化，改變D與A部分的相對(duì)位置，并因此改變了熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。這些傳感器是非常敏感的，由于1 / r的6依賴福斯特的Wechselwirkung的。

熒光壽命（FLIM） - 告訴許多故事

圖 3：影響的FRET熒光壽命。如果福斯特半徑內(nèi)的供體，受體是不是沒有能量轉(zhuǎn)移，興奮狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（無需額外漏）。當(dāng)受體接近供體，能量轉(zhuǎn)移到受體從激發(fā)態(tài)和激發(fā)態(tài)捐助只持續(xù)很短的時(shí)間。

分子或原子的電子系統(tǒng)，由一個(gè)適當(dāng)?shù)哪茉矗伾┑墓庾蛹ぐl(fā)時(shí)，將假定激發(fā)態(tài)。從這個(gè)狀態(tài)下，系統(tǒng)會(huì)放松下來到基態(tài)，散發(fā)出熒光光子。顯然，系統(tǒng)必須縈繞在一段時(shí)間內(nèi)處于興奮狀態(tài)。這段時(shí)間稱為熒光壽命。在一個(gè)孤立的分子，平均壽命由量子物理學(xué)統(tǒng)治，因此物業(yè)的分子。統(tǒng)計(jì)分布的實(shí)際生存的平均壽命。典型的平均壽命跨度的范圍為0.5?10毫微秒。

在現(xiàn)實(shí)中，熒光分子與其他分子的微環(huán)境中與輻射相互作用。這些參數(shù)可以引起興奮狀態(tài)，放松更quickl。一個(gè)眾所周知的現(xiàn)象是動(dòng)態(tài)與其它分子相互作用的熒光淬滅。這里，作為熱能量損失。第二個(gè)途徑是的福斯特Wechselwirkung，如上所述。如果熒光分子（供體）與受體相互作用，平均熒光壽命降低，由于這一事實(shí)，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)額外的競(jìng)爭(zhēng)通路的熒光發(fā)射通路。熒光壽命的變化，因此表明FRET發(fā)生- FLIM的，這是實(shí)際測(cè)量的參數(shù)與生物傳感器。最后，激動(dòng)的狀態(tài)可能與光子相互作用，從而導(dǎo)致進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為其他狀態(tài)，或通過發(fā)射一個(gè)額外的光子（刺激啟動(dòng)返回到基態(tài)發(fā)射）。

排放下降脈沖激發(fā)和隨后的測(cè)量是通過測(cè)量實(shí)際的平均壽命的熒光染料，或通過的調(diào)制激發(fā)和測(cè)量的相位和振幅調(diào)制的發(fā)射。最準(zhǔn)確的和通用的測(cè)量時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）采用從激發(fā)的第一光子發(fā)射的時(shí)間延遲的測(cè)量。其結(jié)果是一個(gè)分布曲線（通常是一個(gè)指數(shù)衰減），它允許提取的壽命曲線擬合。此方法被施加到所有像素的圖像，最后產(chǎn)生的熒光壽命圖像（也被稱為“頭圖”）。在這些圖像中的值是不是灰色的強(qiáng)度，但時(shí)代。

除了感測(cè)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)LIM的獨(dú)立的染料濃度和吸收的工件，例如在深層的樣品。

無圖像的顯微鏡：FCS和衍生工具

圖 4：在HeLa細(xì)胞中的TiF1a-GFP映射的濃度。APD的圖像進(jìn)行的校正與FCS點(diǎn)測(cè)量。投資回報(bào)為FCS測(cè)量顯示為黑色十字架。的濃度，計(jì)算從自相關(guān)曲線（紅色和藍(lán)色的曲線圖）。細(xì)胞內(nèi)的濃度是一個(gè)空間的地圖。相關(guān)曲線測(cè)量點(diǎn)產(chǎn)生顆粒蠕動(dòng)信息。

共聚焦顯微鏡觀察是從一個(gè)微小的衍射光斑發(fā)出的光。該測(cè)量是作為時(shí)間的函數(shù)的光的強(qiáng)度。通過掃描在樣本點(diǎn)和斬波信號(hào)轉(zhuǎn)換成短條，這些位可以被分配并存儲(chǔ)在一幀存儲(chǔ)區(qū)中的像素。如果正確觸發(fā)，幀存儲(chǔ)包含作為一個(gè)兩維空間的功能（圖像）的強(qiáng)度分布。

另一方面，它也有可能只分析信號(hào)及其變化-帶或不當(dāng)場(chǎng)移動(dòng)樣品。這種方法允許多種測(cè)量。首先，平均強(qiáng)度通常會(huì)減少由于漂白現(xiàn)象。此外，三重態(tài)動(dòng)力學(xué)測(cè)量的不同層次之間的照明開關(guān)。最常見的，而不是平均的信號(hào)，但該信號(hào)的變化（波動(dòng)）進(jìn)行了分析。如果是所觀察到的樣品中的許多分子，有關(guān)的信號(hào)的波動(dòng)是非常小的，因此無法估量的。這種微小的共聚焦的焦點(diǎn)只包含幾個(gè)分子（取決于上的光學(xué)參數(shù)和染料濃度，當(dāng)然）具有有益的功能。小分子的數(shù)量足以探測(cè)到由于擴(kuò)散（或任何其他傳輸機(jī)制），焦點(diǎn)體積變化的發(fā)生是由于分子閃爍（分子承擔(dān)暗的狀態(tài)，并返回到興奮狀態(tài)）的數(shù)量和改建。

通過相關(guān)方法的變化的分析，允許測(cè)量的染料濃度（樣品中的局部變化）和傳輸動(dòng)力學(xué)。通過擬合模型系統(tǒng)來測(cè)量的相關(guān)功能，相關(guān)的分子運(yùn)輸機(jī)制的分類是可能的。定性的測(cè)量也是可能的 - 例如，在各個(gè)隔室的擴(kuò)散系數(shù)。

已經(jīng)開發(fā)了各種衍生方法的分離特定的相關(guān)性（FCCS）或改進(jìn)的結(jié)果的可靠性和精確度（FLCS）。

電和光遺傳學(xué)

除了上面提到的F-技術(shù)，很多其他的定量方法在現(xiàn)代研究。最突出的是，大腦的研究是一個(gè)領(lǐng)域的各種測(cè)量，使用顯微鏡和熒光。一個(gè)經(jīng)典的測(cè)量電信號(hào)的熒光強(qiáng)度的變化（例如誘導(dǎo)的Ca 2 +濃度的變化檢測(cè)出鈣指示器）的相關(guān)性。的電信號(hào)通常，在大多數(shù)情況下通過膜片鉗技術(shù)測(cè)量電極。

最先進(jìn)的光遺傳學(xué)的方法，即轉(zhuǎn)基因修改應(yīng)用光功能的蛋白質(zhì)，是進(jìn)入一個(gè)新的世界，需要測(cè)量的相關(guān)性。

圖 5：強(qiáng)度圖（上圖），電氣數(shù)據(jù)（底部）在心肌細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄。電流記錄（紫色），觸發(fā)脈沖（紅色）和行觸發(fā)（綠色）。熒光數(shù)據(jù)線數(shù)據(jù)采集的觸發(fā)表明是完全同步的。禮貌：雷夫霍夫馬德森，西班牙巴塞羅那，加泰羅尼亞心血管病研究所。